野黄苓甙在体外肝脏灌流复苏大鼠无心跳边缘供肝中的作用*

龚 瑾， 兰 薇， 龙 刚， 王西墨， 杜 江， 黄志宇， 陈建帆， 陈 实

(1暨南大学附属第一医院外科，广东 广州 510632；2广东省第二人民医院移植科，广东 广州 510317；3天津市人民医院外科， 天津 300120；4华中科技大学同济医学院器官移植研究所，湖北 武汉 430030)

1000-4718(2012)05-0951-05

2011-11-07

2012-03-27

国家高技术研究发展计划(863计划)(No.2003AA205009)；广东省医学科研基金资助项目(No.A2009356)；广东省中医药局科研基金资助项目(No.2009175)；广州市科技计划(No.2011J4100078)

△通讯作者 Tel: 020-38688613; E-mail: gongjin622@yahoo.com.cn

野黄苓甙在体外肝脏灌流复苏大鼠无心跳边缘供肝中的作用*

龚 瑾△1， 兰 薇2， 龙 刚3， 王西墨3， 杜 江1， 黄志宇1， 陈建帆1， 陈 实4

(1暨南大学附属第一医院外科，广东 广州 510632；2广东省第二人民医院移植科，广东 广州 510317；3天津市人民医院外科， 天津 300120；4华中科技大学同济医学院器官移植研究所，湖北 武汉 430030)

目的探讨野黄苓甙在大鼠体外肝脏灌流复苏无心跳边缘供肝过程中对供肝功能和超微结构的影响。方法采用清洁级雄性Wistar大鼠24只，无心跳供肝按热缺血时间和处理方法的不同随机分为3组。A组(n=8)无心跳供肝的热缺血时间在安全时限内(15～20 min)，B组(n=8)和C组(n=8)无心跳供肝的热缺血时间均为45 min；3组均采用体外肝脏灌流系统(ECLP)常温灌流6 h，其中C组在灌流液中定时加入定量的野黄芩甙溶液。观察灌流后1 h、3 h和6 h供肝胆汁分泌量的变化以及灌流液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和内皮素-1(ET-1)水平的变化；在灌流前和灌流后1 h、3 h和6 h分别取3组供肝标本，通过透射电镜观察肝细胞超微结构的变化。结果B、C 2组供肝在灌流后1 h和3 h胆汁分泌量与A组相比差异显著(P<0.05)，但随着灌流时间的延长，在灌流后6 h 3组差异不显著(P>0.05)，灌流后3 h B和C组差异显著(P<0.05)。灌流液中ALT 和ET-1的水平在3个时点B组、C组与A组相比差异有统计学意义(P<0.05)，B组和C组在灌流后3 h和6 h差异显著(P<0.05)，但在灌流后1 h差异不显著(P>0.05)。超微病理变化显示灌注前与A组相比，B、C 2组供肝的肝细胞线粒体部分膜断裂，嵴疏松溶解,核皱缩变形，染色质粗糙，核仁浓缩甚至裂解。灌流3 h后B、C 2组供肝的超微结构均有明显的恢复，灌流6 h后C组肝细胞结构恢复得更加明显。结论体外肝脏灌流野黄苓甙能够改善无心跳边缘供肝的功能和超微结构。

野黄苓甙； 体外肝脏灌流； 无心跳边缘供肝； 复苏

无心跳供肝(non-heart-beating donor livers，NHBD livers) 的利用是解决临床肝移植中供肝短缺的一个重要途径。经历超过安全时限的热缺血损伤的肝脏被称为边缘供肝，其再经低温保存后进行移植容易导致原发性移植物无功能[1]。野黄苓甙是从天然植物灯盏花中提取的黄酮类活性成分,研究表明其能改善组织缺血后的细胞水肿、凋亡、坏死等病理改变,降低细胞内多种酶的释放、钙内流、脂质过氧化反应、氧自由基水平等[2-3]。本研究将利用自行构建的模拟生理的肝脏体外灌流(extracorporeal liver perfusion，ECLP)系统处理无心跳边缘供肝，观察供肝功能“复苏”的可能性以及野黄苓甙预处理对供肝功能和超微结构的影响，为无心跳边缘供肝的合理应用提供理论依据。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠24只，体质量200～250 g，购于南方医科大学动物所。

1.2器材和药品 蠕动泵(型号: BT01-YZ1515,北京信康亿达科技发展有限公司);热交换器(heat exchanger;Medtro-nic);中空纤维膜式氧合器(hollow fiber oxygenater;Medtronic); 数显控温水温箱(型号: GKX21Cr,上海锦屏仪器仪表有限公司)。灌流液为Krebs-Henseleit溶液，其中加入50%葡萄糖溶液和ATP。野黄苓甙从灯盏花粉剂中分离，提纯获得后制成溶液备用，其化合物结构均经化学和光谱方法鉴定确认，由南开大学化学元素研究所提供。

2方法

2.1实验分组 24只大鼠随机分为3组,每组8只：(1)A组(对照组)：供肝热缺血时间在安全时限(15～20 min)内；(2)B组：供肝热缺血时间为45 min；(3)C组：供肝热缺血时间为45 min。3组供肝切取后连接ECLP系统灌流6 h，其中C组在灌流液中每小时加入野黄苓甙溶液1 mL(含野黄苓甙100 μg)。

2.2灌流系统 参考我们以往设计的猪肝脏灌流系统，在管路和流量控制上做了改进和优化[4]。在参照大鼠生理参数的基础上仍采用同时灌流门静脉和肝动脉，但分别氧合其入肝血流的方式模拟大鼠的体内生理环境。图1为大鼠体外肝脏灌流系统连接示意图。

Figure 1. Hepatic circuit for extracorporeal liver perfusion.

图1肝脏体外灌流循环连接示意图

2.3供肝获取 供体大鼠采用腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液40 mg·kg-1麻醉，仰卧位固定后行腹正中切口。经阴茎背静脉注入肝素钠生理盐水2 mL(含肝素钠500 U)，约5 min后开胸用血管钳夹闭心脏基底部致心脏停搏，热缺血时间自夹闭心脏基底部起至体外灌流前测算。游离肝脏，分离门静脉，肝动脉和肝上下腔静脉后插管并用肝素盐水灌洗后结扎并切断肝下下腔静脉准备连接灌流系统。胆管插入硬膜外麻醉导管以方便测量胆汁的分泌量。

2.4观察指标和检测方法 (1)记录各组肝脏的热缺血时间，用特制的带刻度的小试管测量灌流后1 h、3 h和6 h 3个时点的胆汁分泌量。(2)检测再灌流后1 h、3 h和6 h 3个时点灌流液中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和内皮素-1(endothelin-1，ET-1)的水平。(3)3组供肝分别在切取后和灌流1 h、3 h和6 h取材。每次取小块新鲜肝左外叶组织后放在2.5% 戊二醛磷酸缓冲固定液中切成1 mm×1 mm×1 mm大小进行预固定，并随机取4～5块放回固定液中继续固定； 用蔗糖冲洗液冲洗1～2 h，共3次，过夜；用1%四氧化锇酸缓冲液冲洗后固定1～2 h；用50%、70%、80%、90%乙醇以及无水乙醇各脱水10～15 min。环氧树脂包埋后切片并染色，在透射电镜下观察肝细胞超微结构的改变。

3统计学处理

结 果

1各组供肝灌流期胆汁的分泌量

3组供肝的胆汁分泌量均随灌流时间有升高的趋势，在1 h和3 h 时点B组和C组与A组相比差异显著(P<0.05),但在6 h时点3组相比差异无显著(P>0.05)。B组和C组在1 h时点差异无显著(P>0.05)，但在3 h时点差异显著(P<0.05)，见表1。

表1各组供肝灌流期胆汁分泌量的变化

Group1h3h6hA0.48±0.150.53±0.120.56±0.18B0.28±0.24△0.47±0.19△0.53±0.21C0.29±0.20△0.51±0.22△#0.55±0.16

△P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup B.

2各组灌流液中ALT水平的变化

3组灌流液中ALT水平均随灌流时间延长有升高的趋势，在1 h、3 h 和6 h 3个时点B、C组与A组相比差异均显著(P<0.05)。B组和C组在1 h时点差异无显著(P>0.05)，但在3 h和6 h时点差异显著(P<0.05)，见表2。

表2各组灌流液中ALT水平的变化

Group1h3h6hA266.50±11.38412.73±20.82629.14±18.10B487.26±27.62△632.50±21.24△882.35±31.48△C492.47±22.59△596.42±27.28△#748.73±22.36△#

△P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup B.

3各组灌流液中ET-1水平的变化

3组灌流液中ET-1水平均随灌流时间延长有升高的趋势，在1 h、3 h和6 h 3个时点B、C组与A组相比差异均显著(P<0.05)。B组和C组在1 h时点差异无显著(P>0.05)，但在3 h和6 h时点差异显著(P<0.05),见表3。

表3各组灌流液中ET-1水平的变化

Group1h3h6hA116.46±12.27134.38±18.19142.64±22.15B135.72±24.64△152.62±19.71△168.76±25.21△C136.68±19.52△143.86±20.16△#157.43±23.76△#

△P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup B.

4肝细胞超微结构的变化

A组肝细胞超微结构未见明显变化，细胞间隙稍大，线粒体膜尚清晰。B组和C组在灌流前肝细胞发生严重浓缩，细胞间隙明显增宽。细胞核严重皱缩变形，染色质粗燥。核仁浓缩甚至部分裂解。线粒体严重肿胀，膜发生部分断裂，部分嵴疏松溶解，见图2。和灌流前相比，随着灌流时间的延长2组线粒体的水肿逐渐减轻，细胞间隙变窄，细胞核的结构有所恢复，灌流后6 h时恢复更明显，C组比B组肝细胞超微结构的改善更为明显，见图3。

讨 论

超过安全时限的无心跳供肝由于遭受了较长时间的热缺血损伤,并且在移植过程中不可避免地面临后续的冷保存及再灌注损伤,这些都成为导致原发性移植肝无功能的主要原因而被弃用[5-6]。肝脏缺血再灌注损伤的原因较多，有氧自由基、细胞内Ca2+超载、炎症介质和细胞因子等导致血管内皮细胞的损伤引发微循环障碍，但确切机制仍不清楚。最近的研究表明[7-9]：在肝脏缺血损伤早期，肝细胞的损伤大多处于可复性阶段，通过恢复氧气和能量的供应，可以改善肝细胞的有氧代谢，并使某些可逆性损伤得以恢复。

Figure 2. The ultrastructures of hepatocytes before perfusion(×10 000). A: group A; B: group B; C: group C.

图2灌流前3组供肝的超微结构

Figure 3. The ultrastructures of hepatocytes after 6 h of perfusion.A: group A (×3 000); B:group B (×7 000); C: group C (×10 000).

图3灌流后6h3组供肝的超微结构

本课题小组在前期研究已证明利用自行构建的模拟生理的体外肝脏灌流系统为离体肝脏提供ATP及其前提物质和氧气，能够抑制肝窦内皮细胞和肝细胞的损伤以及继发于内皮细胞损伤引起的微循环障碍[10-11]。野黄苓甙是从中草药灯盏花中分离提取的黄酮类化合物，具有抗凝、扩血管和减轻氧自由基损伤等作用[12-14]，已在心脑血管疾病中广为应用，但在无心跳供肝I/R损伤的防护中研究很少。它是在黄芩素的4位接上1个羟基,从而对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC) 有很好的抑制作用[15-16]。PKC 可广泛传递各种细胞外信息通过细胞膜,调节细胞内许多依赖Ca2+的代谢过程，在缺血/ 再灌流这一病理生理过程中,胞浆中的PKC 移位到细胞膜而被激活,激活的PKC 可以通过加重细胞内钙超载、引起血管收缩、降解细胞骨架成分等途径引起缺血性损伤[17-18]。野黄苓甙已被证明是一种PKC的抑制剂，它能够有效地抑制肝组织PKC的活性从而来减轻肝细胞的损伤，这种抑制并非作用于酶的活性中心，而是通过非竞争抑制来完成[19-20]。

本实验研究发现野黄苓甙在ECLP系统“复苏”边缘供肝中能够进一步改善供肝的功能和肝细胞超微结构损伤的恢复：胆汁的形成经过了极其复杂的肝脏细胞内物质代谢转化和胆道系统的排泌过程，因此胆汁分泌和引流的情况是衡量和观察供肝功能状态的准确和灵敏的的指标[21]。本实验中3组供肝在再灌流初期的胆汁分泌量较少，随着灌流时间的延长而有所增长。这可能与在再灌流后得到维持功能的氧气和能量后一些可逆性损伤得以恢复，肝脏的生理功能也逐渐改善。在肝细胞或线粒体膜损伤时会引起灌流液中许多有关肝脏酶学和反应微循环状况的细胞因子的变化，本实验中各组灌流液中ALT 和ET-1水平的变化反映了肝功能的状态和微循环的改善。电镜下发现scutellarein+ECLP预处理能够明显促进边缘供肝超微结构损伤的恢复，并能在一定程度上逆转线粒体的损伤，这与文献报道和我们前期的研究结果是相符的。

本实验研究表明模拟生理的体外肝脏灌流系统能够“复苏”超过安全时限一定时间的的无心跳边缘供肝，同时利用野黄苓甙预处理能够进一步改善这一病理生理过程中肝细胞功能和超微结构的恢复，但其详细机制还有待于进一步阐明。

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EffectofscutellarinonresuscitatingratNHBMDliverswithextracorporealliverperfusioninvitro

GONG Jin1, LAN Wei2, LONG Gang3, WANG Xi-mo3, DU Jiang1, HUANG Zhi-yu1, CHEN Jian-fan1, CHEN Shi4

(1DepartmentofSurgery,theFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofOrganTransplantation,GuangdongNo.2ProvincialPeople’sHospital,Guangzhou510317,China;3DepartmentofSurgery,TianjinPeople’sHospital,Tianjin300120,China;4InstituteofOrganTransplantation,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:gongjin622@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effect of scutellarin on resuscitating rat non-heart-beating marginal donor (NHBMD) livers with extracorporeal liver perfusioninvitro.METHODSTwenty-four male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: group A (n=8), the livers were subject to 15～20 min of warm ischemia; group B (n=8) and group C (n=8), the livers were subject to 45 min of warm ischemia. All the livers were treated by extracorporeal liver perfusion (ECLP), and scutellarin solution was add to the perfusion fluid in group C with the intervals of 1 h. The data of bile production and the markers of hepatocyte reperfusion injury of the livers,alanine aminotransferase (ALT) and endothelin-1 (ET-1), in each group were tested. The liver tissues in each group were obtained before perfusion and 1 h, 3 h and 6 h after perfusion, and then observed under transmission electron microscope to investigate the changes of ultrastructures.RESULTSWith the time of perfusion went on, the livers in group B and group C demonstrated recovery of synthe-tic function after 3 h and 6 h of perfusion, and the production of bile in group B and group C was not significantly different from that in group A after 6 h of perfusion (P>0.05). The levels of ALT and ET-1 in group B and group C were significantly higher than those in group A after 1 h, 3 h and 6 h of perfusion (P<0.05), and those in group C was significantly lower than those in group B after 3 h and 6 h of perfusion (P<0.05). The ultrastructural destruction of the liver cells in both group B and group C was more serious than that in group A. After 3 h and 6 h of perfusion, the destruction of the liver cells was partly recovered, and the recovery degree in group C was more obvious than that in group B.CONCLUSIONScutellarin may play a significant role in resuscitating rat NHBMD livers with extracorporeal liver perfusioninvitro.

Scutellarin; Extracorporeal liver perfusion; Non-heart-beating marginal donor livers; Resuscitation

R329.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.035