慢性心理应激对大鼠实验性牙周炎及血清乳酸脱氢酶1的影响*

黄世光， 王晓歌， 潘倩茹， 黄 博， 吕芳丽, 叶秀华， 杨云珍， 郭柳婷， 练楚文

(1暨南大学医学院口腔医学系, 广东 广州 510632；2中山大学医学院寄生虫学教研室，广东 广州 510080)

1000-4718(2012)05-0924-05

2011-12-20

2012-03-08

国家自然科学基金资助项目 (No.81071387)；暨南大学优秀本科推免生科研创新培育计划；暨南大学本科生科技创新工程项目(No.CX11139)

△通讯作者Tel：020-85221165；E-mail：thshg@126.com

慢性心理应激对大鼠实验性牙周炎及血清乳酸脱氢酶1的影响*

黄世光1△， 王晓歌1， 潘倩茹1， 黄 博2， 吕芳丽2, 叶秀华1， 杨云珍1， 郭柳婷1， 练楚文1

(1暨南大学医学院口腔医学系, 广东 广州 510632；2中山大学医学院寄生虫学教研室，广东 广州 510080)

目的通过建立大鼠实验性牙周炎模型，探讨慢性心理应激影响牙周炎的致病机制。方法清洁级4 周龄雌性Wistar大鼠80只，随机分为4组：(1)正常对照组；(2)实验性牙周炎组：用浸有牙周致病菌的丝线结扎左侧上颌第二磨牙牙颈部复制牙周炎模型；(3)单纯应激组：牙周不作特殊处理，给予应激刺激；(4)牙周炎+应激组：按上法复制牙周炎模型，并予以应激刺激。各组动物分别于实验后第2、4、6和8 周分批处死，各时点每组处死动物5只。大鼠处死前尾静脉采血检测血糖浓度、心脏采血检测血清促肾上腺皮质激素(ACTH)、乳酸脱氢酶(LDH)及其同工酶LDH1。制作组织切片，HE染色观察大鼠左侧上颌第二磨牙牙周组织的炎性变化及牙槽骨的吸收情况。结果(1)单纯应激组及牙周炎+应激组血糖及血清ACTH水平在2和4 周时明显高于正常对照组和实验性牙周炎组(P<0.01)，牙周炎+应激组在6和8周时血糖及血清ACTH水平仍较正常对照组和实验性牙周炎组高(P<0.01)；(2)牙周炎+应激组血清LDH水平在各时点明显高于正常对照组和实验性牙周炎组(P<0.01)，牙周炎+应激组血清LDH1水平在各时点均明显低于正常对照组和实验性牙周炎组(P<0.01)；(3)组织学观察显示与正常对照组和单纯应激组牙龈及牙槽骨均无明显改变；牙周炎+应激组牙龈组织的炎症及牙槽骨破坏程度在4、6和8周时明显高于牙周炎组。结论应激刺激可能通过降低牙周组织氧代谢水平加重大鼠牙周炎症程度。

牙周炎； 模型，动物； 心理应激； 乳酸脱氢酶

研究表明心理应激是影响牙周病发生、发展和预后的重要因素之一[1]，心理应激影响牙周炎的确切机制至今尚未阐明。牙周组织氧代谢对炎症发展可能有重要影响，而心理应激可能通过影响牙周组织氧代谢而在牙周炎的发生和发展中发挥作用。我们前期的研究显示牙周炎形成过程与组织氧代谢水平下降密切相关[2-3]，牙周炎时牙周组织的肿胀及牙周袋的形成可导致牙周组织处于乏氧状态。

乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是细胞能量代谢中的重要催化酶，参与糖酵解，并能催化丙酮酸还原后生成乳酸，完成葡萄糖无氧酵解的过程，同时释放少量ATP为缺氧状态下的生命活动提供能量。乳酸脱氢酶有LDH1～5共5个同工酶，在发生病变时LDH同工酶谱也发生变化[4]。根据LDH及其同工酶分布特点，通过检测血清乳酸脱氢酶及其同工酶活性的变化可判断组织的氧代谢状况。本文通过建立大鼠实验性牙周炎模型，观察慢性心理应激对牙周炎及牙周组织的影响，同时检测大鼠血清LDH及其同工酶LDH1的水平，以了解慢性心理应激对牙周炎及其氧代谢的影响情况。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 清洁级雌性4周龄SD大鼠80只，体重约150 g，由中山大学医学院实验动物中心提供。

1.2试剂 促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)试剂盒购自Siemens Healthcare Diagnostic Inc.；乳酸脱氢酶测定试剂盒购自四川迈克生物科技股份有限公司；LDH1测定试剂盒购自北京利德曼生化股份有限公司；拜安易血糖检测试纸购自拜耳医药保健有限公司。

2方法

2.1动物模型的制备 用随机数字表法将动物分成4组，每组20只：(1)正常对照组(control group)：牙周不做任何处理；(2)实验性牙周炎组(experimental periodontitis group)：参照Huang等[3]的方法，用浸有牙周致病菌的3/0丝线结扎左侧上颌第二磨牙颈部(图1)复制牙周炎模型; (3)单纯应激组(stress group)：牙周不做结扎处理，每天施以应激刺激；(4)牙周炎+应激组(periodontitis + stress group)：按上法复制牙周炎模型，并于术后第0 d起每天施以应激刺激。各组动物分别于实验后2、4、6和8周分批处死，各时点每组处死动物5只。

Figure 1. A standard ligature picture showed wrapped silk.

图13/0丝线结扎上颌第二磨牙颈部

2.2应激方案 单纯应激组与牙周炎+应激组采用4种应激方案：(1)冲水应激：将大鼠置于空间局限的小铁笼中，将自来水管水量调至最大，连续冲击大鼠2 h，期间不断转动铁笼以改变水流冲击方向；(2)泡水应激：将大鼠置于空间局限的小铁笼中，并用水浸至大鼠锁骨以上位置，浸泡2 h；(3)冰水混合物浸泡应激：将大鼠置于空间局限的小铁笼中，并在笼中加入可浸没大鼠腿部的冰水混合物，浸泡2 h；(4)驱鼠器应激：将大鼠置于单独房间，开启电子驱鼠器24 h。每天随机选择4种应激方法中的1种方法对以上2组大鼠施以应激。

2.3血糖、ACTH、LDH及LDH1的测定 大鼠处死前在非麻醉状态下剪尾取尾静脉血，采用拜安易血糖仪及血糖试纸测定血糖值。2%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后固定大鼠，心脏采血2 mL，室温下于肝素抗凝管静置1 h ，-25 ℃冰箱过夜，4 000 r/min离心10 min，取血清用以测定LDH、LDH1和ACTH。运用IFCC法测定LDH：R1与R2液按4∶1混合，混匀，37 ℃恒温1 min，以空白管调零，测定各管初始吸光度，然后计算吸光度变化值ΔA/min，校准。运用乳酸基质速率法测定LDH1：S+R1液在37 ℃保温60 s后加入R2试剂，保温90 s后测量2 min内的吸光度变化，校准。采用化学发光法测定ACTH，按试剂盒说明书操作。

2.4组织学观察 采用10%中性甲醛溶液心脏灌注处死大鼠，取上颌骨标本于10%中性甲醛溶液中固定48 h以上。剥离左侧上颌第二磨牙颊、腭侧牙龈，制成颊腭向5 μm厚度的牙龈组织切片，HE染色。颌骨标本采用混合脱钙液脱钙，制成近远中向5 μm厚度的牙体牙周组织联合切片，HE染色，光学显微镜下观察牙周组织及牙槽骨的组织学改变。

3统计学处理

结 果

1应激标记物的实验室检测

血糖水平改变见表1，结果显示心理应激组及牙周炎+应激组血糖在2和4 周时明显高于正常对照组和牙周炎组(P<0.01)；心理应激组在6和8周时血糖恢复正常水平(P>0.05)，但牙周炎+应激组血糖水平仍较正常对照组(P<0.01)和牙周炎组高(P<0.01)。

表1各实验组和对照组大鼠血糖水平的变化

Group2weeks4weeks6weeks8weeksControl5.9±1.25.8±1.36.0±1.25.9±1.5Periodontitis5.7±1.55.9±1.45.9±1.45.7±1.6Stress8.3±1.1▲▲8.1±1.2▲▲6.3±1.56.1±1.3Periodontitis+stress8.6±1.3▲▲8.0±1.4▲▲8.2±1.4▲▲8.9±1.7▲▲

▲▲P<0.01vscontrol or periodontitis group.

血清ACTH水平改变见表2，结果显示心理应激组及血清ACTH在2和4 周时明显高于正常对照组和牙周炎组(P<0.01)，在6和8周时血清ACTH有所下降，但仍高于正常对照组和牙周炎组(P<0.05)；牙周炎+应激组血清ACTH在各时点均显著高于正常对照组和牙周炎组(P<0.01)。

表2 各实验组和对照组大鼠血清ACTH水平的变化

▲P<0.05,▲▲P<0.01vscontrol or periodontitis group.

血清LDH水平改变见表3，结果表明牙周炎+应激组血清LDH在各时点明显高于正常对照组和牙周炎组(P<0.01)；单纯应激组除了在2周时明显高于正常对照组和牙周炎组(P<0.01)外，在4、6、和8周时血清LDH水平与正常对照组和牙周炎组相比无显著差异(P>0.05)。

表3 各实验组和对照组大鼠血清LDH水平的变化

▲▲P<0.01vscontrol or periodontitis group.

血清LDH1水平改变见表4，结果显示牙周炎+应激组血清LDH1在各时点均明显低于正常对照组和牙周炎组(P<0.01)，单纯应激组除了在2周时明显低于正常对照组和牙周炎组(P<0.01)外，在4、6、和8周时血清LDH1水平与正常对照组和牙周炎组相比无显著差异(P>0.05)。

表4 各实验组和对照组大鼠血清LDH1水平的变化

▲▲P<0.01vscontrol or periodontitis group.

2组织学改变

正常对照组：牙龈上皮结构完整，结合上皮附着于釉-牙骨质界附近,牙周膜纤维排列整齐，结缔组织内未见明显的炎症细胞浸润，固有牙槽骨形态结构完整，见图2A、B。实验性牙周炎组：牙龈上皮见溃疡，结合上皮向根方增殖，组织深部可见大量炎症细胞浸润，血管扩张充血，胶原纤维变性，牙槽骨表面可见活跃的破骨细胞和骨吸收，呈凹坑状吸收，牙槽嵴顶高度降低，见图2C、D。单纯应激组:牙周组织结构正常，沟内上皮、结合上皮完整，牙周膜纤维排列整齐，牙槽骨未见吸收，见图2E、F。牙周炎+应激组：牙周膜纤维出现胶原疏松、变性，炎症细胞浸润明显，纤维排列紊乱，牙槽嵴顶有破坏吸收，可见破骨细胞和骨吸收陷窝，见图2G、H。

Figure 2. Histological changes of alveolar bone(A,C,E,G;HE staining,×50)and periodontal tissues(B,D,F,H;HE staining,× 100).A,B:control group, no inflammation was found in periodontal tissues；C,D: experimental periodontitis group(4 weeks), moderate inflammation was present；E,F: stress group(6 weeks), no inflammation was found in periodontal tissues；G,H: periodontitis + stress group(8 weeks), severe inflammation was present.

图2各组牙槽骨组织及牙周组织的HE染色结果

讨 论

牙周疾病的发病机制极其复杂，菌斑微生物是牙周病的始动因素，但单纯的细菌因素不足以解释疾病的复杂性和严重性。研究表明心理应激是影响牙周病发生、发展和预后的重要因素之一[5]。在应激影响牙周病的发病机制方面，一些学者认为多种紧张刺激或一种持久反复的紧张刺激可造成免疫防御能力降低，增加机体对致病菌的易感性，从而加重牙周病变。心理应激还可通过刺激交感-肾上腺髓质轴，引起血浆中肾上腺素和去甲肾上腺素浓度升高，参与调控机体对应激的急性反应；同时心理应激介导一系列的代谢和心血管代偿机制如调节心律和外周血管阻力、抑制胰岛素分泌、刺激胰高血糖素的分泌等，导致外周微血管收缩，微循环血液流量减少，从而导致牙周组织处于乏氧状态。

几个相关的研究报道心理压力和牙龈炎症呈正相关[6-7]。Moss等[8]的研究表明社会心理压力是导致大面积牙槽骨丧失的重要原因。心理应激动物模型常采用束缚应激[9]、强迫游泳[10]、抑郁[11]和孤养[12]等。本实验采用冲水、泡水、冰水混合物浸泡和驱鼠器4种应激方法，每天随机选择其中的1种方法对实验的2组大鼠施以应激，模拟人类在社会生活中每天应对的不同精神压力。本实验中检测了应激调节指标如血糖、ACTH浓度，结果显示接受应激刺激的2组大鼠血糖和ACTH水平明显高于正常对照组和牙周炎组，单纯应激组在2周和4周时血糖和ACTH水平显著升高，在4周后血清ACTH水平明显下降，同时组织学观察到牙周组织无任何破坏，表明动物在应激早期处于应激状态, 其内分泌系统对应激刺激发生反应, 同时生物体也能进行适应性调节，4周后应激调节指标逐渐下降，可是ACTH血清水平仍高于正常组和牙周炎组，提示ACTH水平的升高可能与慢性心理应激所致机体缺氧状态下的免疫反应之间有密切联系。牙周炎+应激组在各个观察时点血糖和ACTH水平均处于较高水平，牙周组织炎症和牙槽骨吸收较牙周炎组明显，表明应激能调节牙周炎的发生、发展及牙槽骨丧失过程。

乳酸脱氢酶是催化乳酸和丙酮酸相互转换的酶。在厌氧酵解时，催化丙酮酸接受由3-磷酸甘油醛脱氢酶形成的NADH的氢，形成乳酸。它有LDH1～5共5个同工酶，这5个同工酶是由H型和M型2个亚基排列组合而成的四聚体杂聚分子，其中LDH1与LDH5分别是H4与M4。LDH1主要分布在有氧代谢为主的器官，如心脏，而LDH5则相反。有研究发现LDH1对乳酸的亲和力更强，并且可被很低浓度的丙酮酸盐抑制。氧供应充足时LDH1可以催化乳酸生成丙酮酸以获取能量，LDH5则在厌氧条件下进行糖酵解。Dawson等[13]发现,用猴心肌细胞、鸡心肌细胞和新生鼠肾细胞在减少氧分压情况下，M型亚基增加，提高氧分压则H型亚基合成增加。在新生儿缺氧缺血性脑病中研究结果显示，轻、中、重度患儿LDH水平显著高于正常对照组[14]。王爱华等[15]在急性心肌梗塞(AMI)和同时伴有并发症患者中发现AMI电泳结果LDH1显著增高，而在AMI伴有并发症患者中LDH1降低，LDH5升高，原因是伴心衰或发生心源性休克的病人全身组织缺氧缺血，机体产生无氧代谢，受损的细胞向血液中释放LDH5所致。本实验结果表明牙周炎+应激组血清LDH在各时点明显升高，而LDH1水平明显下降，提示应激加重了牙周炎的缺氧状态，导致牙周炎症的加重及牙槽骨的破坏。

综上所述，单纯应激不会直接导致牙周炎，但是牙周炎患者在应激刺激时通过机体的内分泌-免疫应答系统可能导致牙周组织处于相对乏氧状态，从而加重牙周组织的病变。

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InfluenceofchronicpsychologicalstressonperiodontitisandserumisoenzymeLDH1inrats

HUANG Shi-guang1, WANG Xiao-ge1, PAN Qian-ru1, HUANG Bo2, LÜ Fang-li2, YE Xiu-hua1, YANG Yun-zhen1, GUO Liu-ting1, LIAN Chu-wen1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofParasitology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:fanglilu@yahoo.com)

AIM: To investigate the role of chronic psychological stress on periodontitis and serum level of isoenzyme LDH1 in rats.METHODSEighty female special pathogen-free Wistar rats were randomly divided into 4 groups:(1) normal control group; (2) experimental periodontitis group: the periodontitis model was induced by wrapping 3/0 silk ligature inoculated with putative periodontopathic bacteria around the left maxillary second molar of the rats; (3) psychological stress stimulation group: the rats were treated with stress stimulation alone; (4) periodontitis model with stress stimulation group: the periodontitis models were induced by wrapping 3/0 silk ligature inoculated with putative periodontopathic bacteria around the left maxillary second molar of the rats, and then treated with stress stimulation. The rats were sacrificed at 2nd, 4th, 6th and 8th weeks after ligature. The levels of blood glucose and adrenocorticotropic hormone (ACTH) were measured as the stress markers, and the serum isoenzyme lactate dehydrogenase 1(LDH1) was used to evaluate the severity of hypoxia. The histological changes of periodontal tissues were observed under microscope with HE staining.RESULTSThe levels of blood glucose and ACTH in stress group and periodontitis with stress group were significantly higher than those in control group and experimental periodontitis group at the 2nd and 4th weeks after ligature (P<0.01). The level of serum LDH in periodontitis with stress group was significantly higher than that in control group. The level of serum LDH1 in periodontitis with stress group was significantly lower than that in control group (P<0.01). No difference of histological change in periodontal tissues was observed in control group and stress group. Severer inflammatory changes and alveolar bone destruction were observed in periodontitis with stress group than those in experimental periodontitis group.CONCLUSIONStress stimulation is one of the inducing factors of periodontitis in rats that aggravates periodontitis by decreasing the tissue oxygenation.

Periodontitis; Models,animal; Psychological stress; Lactate dehydrogenase

R78

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.028