结直肠癌原发灶中CXCR6的表达与临床意义*

陈志辉， 宋新明， 李欣欣， 何裕隆

(中山大学附属第一医院胃肠胰外科，广东 广州 510080)

1000-4718(2012)05-0811-05

2012-02-21

2012-04-26

广东省科技计划项目(No.2011B031800118)

△通讯作者 Tel: 020-87755766; E-mail: bigo_sysu@163.com

结直肠癌原发灶中CXCR6的表达与临床意义*

陈志辉， 宋新明△， 李欣欣， 何裕隆

(中山大学附属第一医院胃肠胰外科，广东 广州 510080)

目的明确趋化因子受体CXCR6在结直肠癌原发灶中的表达特点及临床意义。方法收集2004年8月至2008年12月中山大学附属第一医院手术切除的143例结直肠癌标本及29例癌旁组织，应用免疫组化方法检测CXCR6的表达，采用Image-Pro Plus 6.0 软件分析图片的平均累积吸光度(mIA)，分析CXCR6与同时性肝转移及预后的关系。结果CXCR6在结直肠癌组织中呈不同程度的阳性表达，在癌旁正常组织中弱表达或不表达。结直肠癌原发灶中CXCR6的mIA在0.41～2.84之间，平均为1.54±0.04，其中同时性肝转移病例为1.63±0.05，无肝转移病例为1.41±0.08，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。以mIA值1.54为界，将病例划分为CXCR6低表达组(mIA<1.54)和CXCR6高表达组(mIA≥1.54)。CXCR6高表达患者的总生存率显著较低表达组差，两组差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox回归分析发现年龄(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.05)和同时性肝转移(P<0.01)为结直肠癌患者预后的独立危险因素，CXCR6为非独立危险因素。CXCR6表达与IV期肝转移患者预后无关(P>0.05)，与I～III期结直肠癌患者预后呈负相关(P<0.01)。结论CXCR6与结直肠癌肝转移的发生相关，它有望成为结直肠癌肝转移治疗的一个重要靶点。

结直肠肿瘤； 趋化因子； CXCR6蛋白，人； 肝转移； 预后

肝脏是结直肠癌最常见的转移部位，据统计，确诊时约15%～25%的结直肠癌患者出现同时性肝转移，15%～20%接受根治性手术后发生异时性肝转移[1]。

TNM分期及淋巴管浸润是结直肠癌肝转移公认的危险因素[2]，但其分子机制却仍未明确。肿瘤转移的其中一种机制是“种子-土壤”假说，即肿瘤扩散必须同时具备扩散的肿瘤细胞(种子)与适宜的转移生长部位(土壤)，肿瘤细胞侵袭、突破周围组织及基底膜，侵入血管并扩散至循环系统，最后在合适的靶器官定植、生长[3]。然而肿瘤细胞并非在各个器官中均会形成转移灶，每种肿瘤都有自己偏好的转移器官，即所谓的器官特异性转移。最近研究表明，趋化因子受体及其配体除了参与淋巴细胞归巢、细胞迁移黏附及炎症发生等一系列病理生理反应外，还可能在肿瘤细胞增殖、血管新生及器官特异性转移中起着非常重要的作用[4]。CXCL12/CXCR4是目前研究比较深入的一对趋化因子轴，靶器官大量分泌CXCL12，吸引循环中CXCR4阳性的肿瘤细胞在目标器官定植、生长，从而参与各种肿瘤的器官特异性转移[5-7]。然而针对CXCL12/CXCR4的治疗并不能完全抑制肿瘤转移的发生[8]，因此其它趋化因子轴可能也共同参与其中。

CXCR6受体是趋化因子受体家族的另一个重要成员，它与唯一配体CXCL16的相互作用在前列腺癌的骨转移中起着非常重要的作用，阻断CXCR6/Akt/mTOR通路可以明显抑制前列腺癌的血管新生及侵袭[9]。目前CXCL16/CXCR6在结直肠癌肝转移中的作用仍不清楚。因此我们采用免疫组化方法检测结直肠癌标本中CXCR6的表达情况，以期阐明CXCR6在结直肠癌同时性肝转移中的作用及其临床意义。

材 料 和 方 法

1临床资料

收集中山大学附属第一医院2004年8月至2008年12月间外科手术切除的结直肠癌标本143例，取其中29例癌旁正常组织(距离肿瘤>5 cm)作为对照。其中男性93例，女性50例，年龄在25～87岁之间，平均60.3岁。结肠癌76例，直肠癌67例。伴有同时性肝转移83例，无同时性肝转移60例。肿瘤分化程度分为分化型癌(高、中分化型腺癌)及分化不佳型癌(低分化腺癌、未分化腺癌、印戒细胞癌和黏液腺癌)，其中分化型癌121例，分化不佳型癌22例。所有患者均有完整的临床病案资料及随访资料，结直肠癌原发灶及转移性淋巴结均经病理切片检查证实，远处转移经病理学或影像学检查证实。随访采用电话与信件方式结合的方式进行，随访终点为死亡或最终随访日(2011年12月)，随访时间为3～80个月，平均32个月。

2免疫组化检测

取甲醛固定和石蜡包埋的肿瘤组织及癌旁正常组织切片至4 μm厚，经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水后加入3%过氧化氢甲醇液中，室温封闭10 min以抑制内源性过氧化物酶活性。切片在 0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)中95℃下煮沸15 min修复抗原。PBS 漂洗1次后，滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min以阻断非特异性反应，除去多余液体。加入兔抗人CXCR6多克隆抗体(1∶200稀释，Abcam)4 ℃过夜；以PBS液代替Ⅰ抗作为阴性对照。PBS漂洗3次后，滴加多聚体抗兔IgG‐HRP，室温孵育30 min。滴加试剂SABC。PBS漂洗3次后，DAB显色，蒸馏水洗，苏木素复染。乙醇和二甲苯脱水，中性树脂常规封片。

3免疫组化结果判断

采用Image-Pro Plus(IPP)6.0 软件分析免疫组化图片，先测量有效测量区域的面积，再测量该面积范围内目标染色区域的累积吸光度值(integrated absorbance，IA)，两者相除得到平均累积吸光度(mIA)，mIA与CXCR6表达呈正相关。

4统计学处理

应用SPSS 17.0软件包(SPSS Inc)进行统计分析。同时性肝转移与无肝转移组间mIA比较采用Student’st-test。采用Kaplan-Meier法计算总体生存率并描绘生存曲线。采用Cox比例风险模型进行预后的单因素及多因素回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1结直肠癌原发灶及癌旁组织CXCR6的表达

CXCR6在细胞质和细胞膜中呈不同程度的阳性表达，见图1A、B，部分肿瘤间质浸润的炎症反应细胞亦呈CXCR6弱阳性表达，见图1A。CXCR6在结直肠癌组织中呈不同程度阳性表达，见图2A、B、C，而在癌旁正常组织中呈少量弱表达或不表达，见图2D。

2CXCR6表达与结直肠癌同时性肝转移的关系

143例结直肠癌患者的基本资料见表1。结直肠癌原发灶中CXCR6mIA在0.41～2.84之间，平均为1.54±0.04，其中同时性肝转移病例的mIA为1.63±0.05，无肝转移病例为1.41±0.08，两组比较差异有统计学意义(t=2.529，P<0.05)。mIA在无淋巴结转移与有淋巴结转移病例中无明显差异(P>0.05)，在无脉管浸润与有脉管浸润病例中亦无明显差异(P>0.05)。

Figure 1. Expression of CXCR6(×400).: cell membrane; ▶: intercellular matrix.

图1CXCR6在细胞膜、细胞质及肿瘤间质中表达

Figure 2. Positive staining of CXCR6 (A:strong;B:intermediate;C:weak) in colorectal cancer and negative staining (D) in adjacent normal colorectal tissues(×400).

图2CXCR6在结直肠癌和癌旁正常组织中的表达

表1143例结直肠癌患者基本资料

Table 1. Baseline characteristics of the patients with colorectal cancer (n=143)

CharacteristicsDataAge[year.x±s(range)]60.3±1.1(25～87)Age≥60[n(%)]83(58.0)Male[n(%)]93(65.0)CXCR6mIA[x±s(range)]1.54±0.04(0.41～2.84)CXCR6mIA≥1.54[n(%)]66(46.7)Rectalcancer[n(%)]67(46.9)Tumorsize≥5cm[n(%)]95(66.4)Undifferentiatedtumor[n(%)]22(15.4)Lymphovascularinvasion[n(%)]38(26.6)T3～T4[n(%)]131(91.6)Lymphnodemetastasis[n(%)]105(73.4)Synchronouslivermetastasis[n(%)]83(58.0)

mIA：mean integrated absorbance

3CXCR6表达与结直肠癌患者预后的关系

根据CXCR6mIA的平均值1.54将病例划分为CXCR6高表达组(mIA≥1.54)和CXCR6低表达组(mIA<1.54)，结果CXCR6低表达组1、3、5年总体生存率分别为81.8%、53.2%和32.3%，CXCR6高表达组1、3、5年总体生存率分别为81.8%、28.4%和11.2%，两组总生存率比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

Figure 3. Overall survival rate in high CXCR6 expression group was poorer than that in low CXCR6 expression group (P<0.05).

图3CXCR6表达与结直肠癌患者预后呈负相关

Cox单因素分析发现CXCR6、淋巴结转移、同时性肝转移及脉管浸润及年龄与结直肠癌患者总生存率相关，但多因素分析结果提示，只有年龄(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.05)和同时性肝转移(P<0.01)为结直肠癌患者预后的独立危险因素，CXCR6为非独立危险因素，见表2。

83例同时性肝转移结直肠癌患者的中位生存时间为21个月，其中CXCR6高表达者为21个月，CXCR6低表达者为18个月，两者差异无统计学意义(P>0.05)，见图4A。60例无同时性肝转移的I～III期结直肠癌患者中位生存时间为45个月，其中CXCR6高表达者为31个月，CXCR6低表达者为56个月，两者差异有统计学意义(P<0.01)，见图4B。

讨 论

CXCR6受体是跨膜G蛋白偶联受体超家族成员之一，其N 端区域与趋化因子配体结合, 胞内区与G蛋白偶联,而C 端具有多个可磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基, 主要参与细胞信号转导。趋化因子配体与受体结合后在淋巴组织生成、淋巴细胞归巢、细菌感染、类风湿性关节炎及皮肤病等一系列病理生理活动中起着非常重要的作用[10-12]，近年还发现其与肿瘤的发生、发展和转移有关。

表2 143例结直肠癌患者预后单因素及多因素Cox回归分析

OR: odd ratio； CI： confidence interval.

Figure 4. High CXCR6 expression was associtated with poorer overall survival in the patients with stage I～III colorectal cancer (P<0.01, B) but not those with synchronuse liver metastasis (P>0.05, A)

图4CXCR6表达与结直肠癌同时性肝转移患者预后的关系

本研究结果表明，CXCR6主要在癌组织中表达，而在癌旁正常组织弱表达或不表达，这表明CXCR6参与了结直肠癌的发生。鉴于CXCR6在癌组织中广泛表达，我们难以利用传统的肉眼评判标准作出准确的判断，因此本研究采用了IPP 6.0图像分析系统测平均密度的方法进行结果判断。我们发现CXCR6表达与同时性肝转移的发生有关(P<0.05)，但与淋巴结转移及脉管浸润无关，该结果与既往的研究是一致的[13-14]。Cambien等[13]的研究发现，阻断CXCR3可显著减少HT29细胞肺转移的发生，却不能抑制肝转移。因此肿瘤转移是非随机的器官选择性过程，不同类型的癌转移目的地不同，不同的趋化因子信号通路在不同的器官特异性转移中所起的作用。此外，现已明确CXCL16在肝细胞、胆管上皮细胞及窦状隙内皮细胞阳性表达[15-16]，这进一步为CXCL16/CXCR6参与肝转移的发生提供了强有力的证据。

对于趋化因子是否系肿瘤患者预后的独立危险因素，目前各家报道差异较大[17-19]。我们研究发现，尽管CXCR6高表达组的总体生存率明显比低表达组低，但经过淋巴结转移、同时性肝转移、脉管浸润及年龄等多因素校正后，我们发现CXCR6并不能作为结直肠癌患者预后的独立危险因素。尽管CXCR6表达情况与IV期肝转移患者预后无关，但其与I-III期结直肠癌患者的预后呈负相关，这与近年日本的一项研究的结果是一致的[20]。他们发现I～III期结直肠癌患者血清中的CXCL16水平与异时性肝转移的发生呈正相关，术前血清CXCL16水平可用于预测结直肠癌患者肝转移的发生[20]。

综上所述，CXCR6与结直肠癌同时性肝转移相关，结直肠癌组织中CXCR6的表达水平检测对评估结直肠癌的转移及预后有一定的指导意义。CXCL16/CXCR6参与肝转移的具体分子机制及其与异时性肝转移的关系仍需进一步研究。CXCR6可望成为结直肠癌肝转移治疗的一个重要靶点。

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ExpressionandclinicalsignificanceofchemokinereceptorCXCR6inprimarycolorectalcancer

CHEN Zhi-hui, SONG Xin-ming, LI Xin-xin, HE Yu-long

(DepartmentofGastrointestinalandPancreaticSurgery,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:bigo_sysu@163.com)

AIM: To investigate the expression of chemokine receptor CXCR6 in primary colorectal cancer and determine the association between CXCR6 expression and synchronous liver metastasis/prognosis.METHODSThe colorectal cancer tissues from 143 patients were collected from August 2004 to December 2008 in the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University. Twenty-night cases of the adjacent normal colorectal tissues were enrolled as controls. The expression of CXCR6 was detected by immunohistochemistry and the mean intergrated absorbance (mIA) was calculated by Image-Pro Plus 6.0 software. The relationship between CXCR6 expression and synchronous liver metastasis/prognosis was analyzed.RESULTSThe CXCR6 staining was mainly positive in colorectal cancer tissues but not in adjacent normal colorectal tissues. ThemIAof CXCR6 in colorectal cancer was 1.54±0.04 (range: 0.41～2.84), and was 1.63±0.05 and 1.41±0.08 (P<0.05) in the cases with (n=83) or without (n=60) synchronous liver metastasis, respectively. According to the meanmIAof CXCR6 (1.54), the cases was divided into high CXCR6 group (mIA≥1.54) and low CXCR6 group (mIA<1.54). The overall survival rate in high CXCR6 group was significantly lower than that in low CXCR6 group (P<0.05). In multivariate Cox regression models, age (P<0.05), lymph node metastasis (P<0.05) and synchronous liver metastasis (P<0.01) but not CXCR6 were identified as independent risk factors for poor outcome. In subgroup analysis, high CXCR6 expression was associated with poorer survival in the patients with stage I～III colorectal cancer (P<0.01) but not those with synchronous liver metastasis (P>0.05).CONCLUSIONCXCR6 in primary colorectal cancer tissues is associated with liver metastasis. It may become a potential target for the treatment of colorectal cancer liver metastasis.

Colorectal neoplasms; Chemokines; CXCR6 protein,human; Liver metastasis; Prognosis

R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.008