酸性成纤维细胞生长因子复方保存液对大鼠肝脏低温保存的作用*

许 华， 苏本金， 江海香， 黄亚东

(暨南大学1药学院，2医药生物技术研究开发中心，广东广州510632)

原发性移植物无功能(delayed graft function，DGF)一直是器官移植界多年来未能解决的问题。近年来，有学者发现器官在体外低温保存期间失去了正常存在于血浆中的营养因子(trophic factors，TFs)对细胞的营养和支持作用，这可能与DGF的发生有关［1］。此后，新型营养因子保存液逐渐成为器官保存液研制的一个热门方向［2－3］。酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)作为营养因子的重要成员，具有创伤修复、神经调节、神经保护和内脏保护等活性，对缺血再灌注脏器起到很好的保护效果［4－5］。本研究采用低温保存模型，以临床常用的高渗枸橼酸盐腺嘌呤(hypertonic citrate adenine，HCA)溶液作为对照，研究aFGF对供肝的保存效果。

材料和方法

1 药品与溶液的配制

重组人 aFGF14－154，浓度为 0．126 g/L，比活性 8．3 × 108U/L，由暨南大学医药生物技术研究开发中心研制。HCA液，配方为 K+80 mmol/L，Na+80 mmol/L，MgSO441 mmol/L，枸橼酸55 mmol/L，腺嘌呤 0．38 mmol/L，甘露醇 30 g/L，pH 值7．0 ± 0．1，渗透压为380 mOsm/L。aFGF复方保存液，即在HCA保存液中加入aFGF14－15440μg/L。考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue，CBB)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。

2 动物与分组

健康雄性Wistar大鼠24只，体重180～200 g，清洁级动物，购自中山大学医学院实验动物中心。随机分为单纯HCA保存液组(对照组)和aFGF复方保存液组(实验组)，每组12只;根据离体肝脏保存的不同时间，再分为2个亚组，每组6只。

3 大鼠离体肝脏单纯低温保存模型的制备

实验前大鼠禁食不禁水12 h，实验时用10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。手术，游离左肾静脉水平以下的腹主动脉结扎阻断，在肾脏动脉下方1．5 cm处的腹主动脉插入留置针并固定，利用三通注射含100 U肝素生理盐水1 mL，完毕后开始灌注单纯HCA液或aFGF复方保存液。灌注液置于低温4℃条件下保存，按12 mL/min流速灌注。开始灌注的同时手术线阻断腹腔动脉以上的腹主动脉，并迅速剪开肝上、下的下腔静脉，让灌洗液顺利流出，约5 min，使肝脏呈现质地均匀土黄色。切取供肝吸干称重后置于4℃等体积的保存液中。

4 观察指标

4．1 肝脏保存前后重量差 计算公式为:肝脏重量差(g)=保存后肝重量(g)－保存前肝重量(g)。

4．2 生化指标 供肝保存12和24 h后，分别取肝脏保存液2 mL于－80℃冰箱中，待测ALT和AST含量;分别取肝中叶组织1 g置于－80℃冰箱，待实验完成后同批测定MDA含量。

4．3 组织病理学变化 取肝中叶组织约1．0 cm ×0．5 cm×0．5 cm投入20倍于肝体积的4%多聚甲醛溶液中固定，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片及HE染色，光镜下观察。

5 统计学处理

用SPSS统计软件包进行分析，数据用均数±标准差(¯x±s)表示，组间比较使用t检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同时间保存后肝脏重量的变化

肝脏的重量随保存时间延长而增加。在12 h保存时点，2组肝脏的重量差无显著差异(P＞0．05)，而在24 h保存时点，实验组肝脏重量差为(0．79±0．20)g，明显低于对照组肝脏重量差［(1．10±0．40)g］，2组间比较差异显著(P ＜0.05)，见图1。

Figure 1．Changes of liver weight difference after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA or aFGF compound solution．¯x±s．n=6．*P＜0．05 vs HCA group．图1 各组大鼠肝脏重量的变化

2 不同保存时间后保存液中ALT和AST活性的变化

保存液中ALT和AST变化见表1。在12 h时点，实验组ALT活性明显低于对照组，2组间比较差异显著(P＜0．05);在24 h时点，实验组ALT和AST活性与对照组相比差异显著(P＜0．05)，且实验组 ALT明显低于对照组(P ＜0．01)。这表明实验组的肝损害程度明显低于对照组，即aFGF对所保存供肝具有一定的保护作用。

表1 各组大鼠肝脏ALT和AST活性的比较Table 1．The activity of ALT and AST after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA solution or aFGF compound solution(103 U/g．¯x±s．n=6)

3 保存后不同时点肝脏组织中MDA含量的变化

肝脏在2种保存液中4℃保存12 h后，其MDA含量无显著差异(P＞0．05)，而在24 h保存时点，实验组MDA含量明显低于对照组 (P＜0．05)，见图2。

Figure 2．Content of MDA after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA or aFGF compound solution．¯x±s．n=6．*P ＜0．05 vs HCA group．图2 各组大鼠肝脏MDA含量的变化

4 不同时点保存后肝脏组织病理学改变

肝脏保存12 h后，HCA组肝小叶中央静脉周围有肝细胞肿胀、细胞核固缩、胞浆深染等变化，见图3A;而实验组肝细胞连接相对紧密，肝索排列有序，见图3B。24 h时对照组肝组织水肿严重，细胞破碎排列松散，嗜酸性增强，核深染固缩，见图3C;而实验组肝细胞仍能维持较完整的形态，见图3D。

Figure 3．Morphological changes of liver after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA or aFGF compound group(HE staining，×400)．A:12 h in HCA group;B:12 h in aFGF compound group;C:24 h in HCA group;D:24 h in aFGF compound group．图3 各组大鼠肝脏HE染色结果

讨 论

已有的实验表明，生物营养因子具有显著减轻多种离体脏器冷缺血的损伤。McAnulty等［2］首次在UW保存液中补充了多种生物营养因子，包括表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin － like growth factor，IGF－1)和神经生长因子(nerve growth factor，NGF)等对狗进行肾脏移植实验，结果显示，营养因子添加组显著改善了低温肾脏保存的质量和持久性，能实质性地防止冷缺血损伤。随后，在其它的器官移植的研究中，研究者发现营养因子同样对肝脏、心脏保存起到很好的保存作用［6－7］。aFGF作为生物营养因子重要成员之一，与其它生物营养因子NGF、EGF、IGF相比，具有促进细胞增殖、分化，促进新生血管形成，促进创伤愈合与组织修复、再生并参与神经再生等广泛的生物活性。但尚未见将aFGF用于器官保存液的研究报道。

本研究通过观察HCA保存液和aFGF复方保存液对大鼠肝脏的保存作用，探讨了aFGF对肝脏低温保存效果的影响。结果表明，HCA对照组在肝脏保存12 h具有良好的肝脏保护效果，但24 h时肝脏发生较明显的水肿，可能是因为长时间低温冷冻保存抑制了细胞膜上离子泵的活性，导致细胞膜通透性增高，引起离子紊乱，以致HCA液易发生细胞的水肿［8］。多器官保存液HCA中加入aFGF，可明显改善原HCA液对肝脏的冷藏保存效果。aFGF复方保存液组肝重量差减小，表明aFGF可拮抗随保存时间延长而出现的肝脏水肿的不断增加，这可能是aFGF参与了细胞张力调节，影响细胞钙离子浓度平衡，抑制细胞发生肿胀，保护了细胞膜［9］。

氧自由基在缺血缺氧时可加强脂质过氧化反应，损伤细胞膜，以及线粒体功能障碍，造成细胞损伤和死亡［10］。aFGF复方保存液组MDA含量较HCA组显著降低，表明aFGF具有一定的抗氧化损伤作用，可能是aFGF的非促分裂活性，即神经和血管保护作用、激素样特性等，保护细胞膜免受冷保存时细胞自由基水平升高所致的损伤［11－13］。aFGF复方保存液组肝灌洗液中ALT和AST活性比对照组下降更为显著，进一步验证了aFGF对肝细胞的保护作用，具有降低组织损伤或坏死的作用［14］。以上结果表明，aFGF复方保存液具有减轻肝损伤的作用，其机制可能是:(1)抑制细胞肿胀;(2)拮抗氧自由基的损伤，从而减轻肝损伤。因此，aFGF弥补了HCA液易发生细胞的水肿和对无氧自由基清除能力不足的缺陷，两者产生了互补和(或)协同作用。

综上所述，在HCA保存液中加入aFGF，在一定程度上减轻了大鼠肝脏灌注及冷保存所致肝细胞损伤，其机制可能与aFGF抑制肝细胞肿胀及拮抗自由基损伤双重作用有关。能否将aFGF等一系列的营养因子作为临床器官保存液的常规添加剂、加入多大浓度的aFGF更合适、常用器官保存液配方对aFGF作用的影响等问题，值得进一步研究。

［1］ Arai S，Mochida S，Ohno A，et al．Decreased expression of receptors for vascular endothelial growth factor and sinusoidal endothelial cell damage in cold－preserved rat livers［J］．Transplant Proc，1999，31(6):2668 －2672．

［2］ McAnulty JF，RPReid TW，Waller KR，et al．Successful six－day kidney preservation using trophic factor supplemented media and simple cold storage［J］．Am J Transplant，2002，2(8):712 －718．

［3］ Kwon YS，Foley JD，Murphy CJ，et al．The effect of trophic factor supplementation on cold ischemia－induced early apoptotic changes［J］．Transplantation，2007，83(1):91－94．

［4］ Cuevas P，Martinez－ Coso V，Fu X，et al．Fibroblast growth factor protects the kidney against ischemia－reperfusion injury［J］．Eur J Med Res，1999，4(10):403 －410．

［5］ 许 华，海广范，许 虹，等．非促分裂型人酸性成纤维细胞生长因子对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用［J］．中国病理生理杂志，2008，24(3):552－557．

［6］ Thibault D，Giraud S，Cau J，et al．Trophic factor and FR167653 supplementation during cold storage rescue chronic renal injury［J］．J Urol，2011，185(3):1139 －1146．

［7］ Ambiru S，Uryuhara K，Talpe S，et al．Improved survival of orthotopic liver allograft in swine by addition of trophic factors to University of Wisconsin solution［J］．Transplantation，2004，77(2):302－319．

［8］ 古维立，翁杰锋，肖 海，等．不同灌注方式对供肝质量的影响［J］．广东医学，2008，29(10):1623－1625．

［9］ 孙同柱，付小兵，陈 伟，等．改构型酸性成纤维细胞生长因子对肠缺血－再灌注的保护作用［J］．中国危重病急救医学，2005，17(1):46－48．

［10］ Dicken DHK，Fuggle SV．Chemokines in ischemia/reperfusion injury［J］．Curr Opin Org Transplant，2002，7(2):100－106．

［11］ Cuevas P，Carceller F，Lozano RM，et al．Protection of rat myocardium by mitogenic and non－mitogenic fibroblast growth factor during post－ ischemic reperfusion［J］．Growth Factors，1997，15(1):29 －40．

［12］ Lozano RM，Pineda－Lucena A，Gonzalez C，et al．1H NMR structural characterization of a non－mitogenic，vasodilatory，ischemia－protector and neuromodulatory acidic fibroblast growth factor［J］．Biochemistry，2000，39(17):4982－4993．

［13］ 李 彦，李 菁，李校堃，等．改构型酸性成纤维细胞生长因子对离体大鼠缺氧再灌注心脏的保护作用［J］．中国病理生理杂志，2005，21(5):855－858．

［14］ Xu H，Hai GF，Xiang JZ，et al．Protective effect of non－mitogenic human acidic fibroblast growth factor on hepatocyte injury［J］．Hepatol Res，2007，37(10):836 －844．