肺癌干细胞中存在容积激活氯通道*

毛张凡， 徐小惠， 黄 杰， 耿 庆， 康敢军

(1武汉大学人民医院胸外科，湖北武汉430060;2华中科技大学同济医院药剂科，湖北武汉430030)

肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。尽管肺癌的治疗手段日新月异，但其5年生存率经多年研究仍无明显改善。肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)学说的提出为癌症治疗带来了新的曙光。有研究表明干细胞中存在多种离子通道电流，如大鼠骨髓间质干细胞、大鼠胚胎干细胞和小鼠心脏干细胞中均存在不同类型的离子通道电流［1－4］。研究显示容积激活氯通道(volume－activated chloride channel，VACC)与肿瘤的发生发展关系密切。其参与肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡并与肿瘤的多药耐药性密切相关［5－6］。但目前对VACC和肿瘤关系的研究均限于已分化肿瘤细胞。因此本实验观察CSCs中是否存在VACC，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。

材料和方法

1 细胞分选、培养及纯度测定

肺癌细胞系A549(购自上海研吉生物科技有限公司)用含10%胎牛血清(Gibco)的RPMI－1640培养基(Gibco)培养，细胞传代和收集均采用0．25%胰酶消化进行。采用免疫磁珠分选(magnetic cell separation，MACS)法分离肺癌细胞系A549中的CD133+和CD133－细胞，MACS体系为Miltenyi产品。取对数生长期的肺癌细胞系A549细胞108个，离心后重悬于400μL磁珠分选缓冲液中，加入100μL FcR封闭剂。制成单细胞悬液后与100μL CD133磁珠避光4℃孵育30 min。加入5 000 μL buffer，300×g离心10 min，洗涤细胞。用500μL MACS缓冲液重悬细胞。将磁分选MS柱放入磁分选器，加入500μL MACS缓冲液洗柱2次，加入细胞悬液，未与磁珠结合的CD133－细胞随缓冲液流出。500μL MACS缓冲液冲洗吸附柱3次。将MS柱移出分离器，1 000μL磁珠分选缓冲液冲洗即获得纯化的CD133+细胞。为获取更高纯度，可将阳性分选产物加于另一新的分选柱，阴性细胞流出，500μL MACS缓冲液冲洗吸附柱3次，重复以上的阳性分选过程。为防止CD133+细胞分化，分选后所获CD133+细胞用含20μg/L表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF，Peprotech)和10μg/L碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，Peprotech)的无血清RPMI－1640培养基重悬，培养。

流式细胞仪(Becton Dickinson)测定分选的CD133+细胞磁珠分选纯度。1×106个细胞重悬于500μL缓冲液中，加入5μL CD133/APC荧光标记的抗体(克隆TMP4，e－Bioscience)，4℃孵育30 min后上机检测。

2 膜片钳记录电流

采用全细胞膜片钳记录方法，应用膜片钳放大器(HEKA，EPC－9，German)和 PULSE软件(HEKA，Lambrecht，German)在电压钳制状态下记录CSCs上的容积激活氯电流。吸取细胞液少许，加入1 mL细胞池内，该细胞不易贴壁，故待细胞沉底行封接后，再以细胞外液灌流。玻璃电极(外径1．2 mm)经微电极拉制仪分二步拉制而成，充灌电极内液进入细胞外液后阻抗为2．0～3．0 MΩ。电极接触细胞前补偿液接电位，轻施负压进行封接，使封接电阻达GΩ以上。形成高阻封接后，继续施加脉动负压或给予短暂电脉冲击穿膜片形成全细胞记录模式。补偿瞬时和缓慢电容电流，并根据需要补偿串联电阻，钳位误差控制在小于5 mV。通过膜片钳放大器发放刺激冲动，激发的电流信号经AgCl－Ag电极引导、放大器放大，由A/D转换器转换为数字信号，存于硬盘中以备分析。电流信号经截止频率2．9 kHz的四阶贝塞尔低通滤波，采样频率5 kHz。实验控制在室温22～23℃。所有细胞电流记录均是在分选后24 h内完成。

台式液(mmol/L):136 NaCl，5．4 KCl，1．0 MgCl2，1．8 CaCl2，0．33 NaH2PO4，10 glucose，10 HEPES，用 NaOH 将 pH值调至7．3。低渗台式液(0．6T，～180 mosmol/L)由台式液中NaCl从140减至80 mmol/L制备。等渗台式液(1T，～300 mosmol/L)由0．6T低渗台式液中加入125 mmol/L甘露醇制备。电极内液 (mmol/L):20 KCl，110 K －aspartate，1．0 MgCl2，10 HEPES，5 EGTA，0．1 GTP，5．0 Na2－ phosphocreatine和5．0 Mg2－ATP，用KOH 将 pH值调至7．2。氯通道阻滞剂5－nitro－2－(3－phenylpropylamino)benzoic acid(NPPB)购自Tocris(Bristol)。其余试剂均购自Sigma。

结 果

1 免疫磁珠法分选、纯化肺CD133+CSCs

用免疫磁珠法从非小细胞肺癌细胞系A549中分离得到CD133+的CSCs，并用流式细胞仪检测其纯度约92%，见图1A、B。

Figure 1．The purity of CD133+and CD133－ cells．A:the purity of CD133+was 92．14%;B:the purity of CD133 － was 98．62%．图1 CD133+和CD133－细胞纯度

2 在CD133+的CSCs记录到容积激活氯电流

膜片钳钳制电位－40 mV，施予－100～+70 mV、阶跃10 mV、300 ms去极化脉冲。CD133+CSCs表现为小股内向电流和大股伴随着外向整流的外向电流。对钾通道阻滞剂［5 mmol/L 4 － AP，5 mmol/L tetraethylamminonium(TEA)，0．5 mmol/L Ba2+］不敏感，说明该电流不是钾电流;可被氯通道阻滞剂［100μmol/L 5－nitro－2－(3－phenylpropylamino)benzoic acid(NPPB)］阻断，说明该电流为氯电流。为研究是否为容积激活性氯通道，将细胞外液由等渗(1T)换为低渗(0．6T)后，可观察到细胞肿胀诱导产生的膜电流明显增强，并可被NPPB阻断(10 min)。NPPB被洗脱后，膜电流强度恢复(10 min)。

共用全细胞膜片钳记录40个CD133+CSCs，在其中22个细胞上记录到容积激活氯电流，见图2。

讨 论

CSCs是肿瘤发生及复发的根源，故对CSCs的研究可能从根本上了解肿瘤，治疗肿瘤。目前已从血液系统及乳腺、脑、前列腺、胰腺、黑色素瘤、大肠、肺的恶性肿瘤中分离得到CSCs。CD133常在各种肿瘤干细胞的研究中用于标记CSCs。Eramo等［7］及 Tirino等［8］以 CD133 为表面标志分离得到小细胞肺癌和非小细胞肺癌的CSCs。本实验用免疫磁珠法从非小细胞肺癌细胞系A549中分离得到的CD133+CSCs，并用流式细胞仪检测其纯度约92%。

离子通道通常在兴奋组织中存在并起非常重要的生理作用，如心血管系统。最近的研究表明离子通道与肿瘤亦关系密切。如离子通道在非兴奋性组织起源的肿瘤中高表达，而在相同起源的正常组织中低表达或不表达;并且在肿瘤的发生发展过程中，离子通道表达类型和活性发生改变，并与肿瘤细胞的增殖和凋亡密切相关。随着研究的深入，发现钾、钠、氯、钙通道在肿瘤发生发展的不同阶段均发挥重要作用，它们通过对膜电位、细胞周期、胞内第二信使(cAMP、cGMP、Ca2+等)浓度、胞质pH值及细胞体积等进行调节，影响肿瘤细胞增殖、分化和凋亡;而且参与肿瘤转移及血管形成［9］。各类离子通道协同作用，与参与其中的信号途径形成复杂而庞大的网络，共同调控肿瘤的增殖、分化、转移、凋亡等生物学特性［10］。

Figure 2．Voltage－dependent current was recorded in a representative cell with 300 ms voltage steps between －100 and+70 mV from a holding potential of－40 mV，then back to －40 mV as shown in the inset．Voltage－dependent current was recorded during 1T(isotonic solution)，0．6T(hypotonic solution)plus100 μmol/L NPPB．The 0．6T －induced current was outwardly rectifying and significantly inhibited by NPPB at test potential．图2 全细胞膜片钳记录的容积激活氯电流

目前尚无对CSCs的膜电流研究，本实验旨在研究CSCs中的氯通道。在氯通道与肿瘤的关系中，对VACC研究较为深入，其参与肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡并与肿瘤的多药耐药性密切相关，且以ClC－3较为重要［5］。VACC在多种肿瘤组织中高表达，其阻滞剂能显著抑制肿瘤细胞的增殖。VACC还参与肿瘤细胞的迁移。肿瘤细胞在迁移过程中为了适应新的环境，往往要发生体积形态的变化，VACC即是在这个过程中起重要作用。凋亡性容积减小(apoptotic volume decrease，AVD)是细胞凋亡早期等张性体积皱缩现象，启动细胞凋亡的发生。VACC是AVD中氯离子外流的重要途径，与肿瘤细胞凋亡的启动密切相关，发挥重要作用［11］。由于氯离子通道既受细胞信号转导通路的调节，又是细胞内外大分子交换的通路，故已有研究证实氯通道与肿瘤多药耐药性的关系密切［12－13］。如P－糖蛋白(P －glycoprotein，P －gp)由多药耐药基因编码，是细胞膜上一种能量依赖性药物排出泵，具有容积激活氯通道功能，P－gp能将化疗药物泵出胞外，导致耐药。氯通道阻滞剂可封闭P－gp，显著抑制药物外排，逆转肿瘤的耐药性［14］。CSCs对化疗药具有天然的耐受性，容积激活氯通道可能与之有关。

本实验中通过全细胞膜片钳在肺癌CD133+CSCs中记录到容积激活氯电流。曾有学者在骨髓间充质干细胞及心脏干细胞中记录到容积激活氯电流，并证明其通道蛋白类型为ClC－3［2，4］，本实验结果与其一致。目前以ClC－3为靶点的药物已进入二期临床试验阶段，故本实验结果意义重大。本实验是首次对肿瘤干细胞电生理的研究，将为后续研究奠定基础。

［1］ Bettiol E，Clement S，Krause KH，et al．Embryonic and adult stem cell－derived cardiomyocytes:lessons from in vitro models［J］．Rev Physiol Biochem Pharmacol，2006，157:1－30．

［2］ Tao R，Lau CP，Tse HF，et al．Functional ion channels in mouse bone marrow mesenchymal stem cells［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2007，293(5):C1561 － C1567．

［3］ Wang K，Xue T，Tsang SY，et al．Electrophysiological properties of pluripotent human and mouse embryonic stem cells［J］．Stem Cells，2005，23(10):1526 －1534．

［4］ Han Y，Chen JD，Liu ZM，et al．Functional ion channels in mouse cardiac c － kit+cells［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2010，298(5):C1109 － C1117．

［5］ Poulsen KA，Andersen EC，Hansen CF，et al．Deregulation of apoptotic volume decrease and ionic movements in multidrug－resistant tumor cells:role of chloride channels［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2010，298(1):C14 －C25．

［6］ 陈丽新，王立伟，朱林燕，等．Cl－在鼻咽癌细胞调节性容积回缩中的作用［J］．中国病理生理杂志，2002，18(5):490－493．

［7］ Eramo A，Lotti F，Sette G．Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population［J］．Cell Death Differ，2008，15(3):504 －514．

［8］ Tirino V，Camerlingo R，Franco R．The role of CD133 in the identification and characterisation of tumour－initiating cells in non－ small－ cell lung cancer［J］．Eur J Cardiothorac Surg，2009，36(3):446－453．

［9］ Kunzelmann K．Ion channels and cancer［J］．J Membr Biol，2005，205(3):159 －173．

［10］ Prevarskaya N，Skryma R，Shuba Y．Ion channels and the hallmarks of cancer［J］．Trends Mol Med，2010，16(3):107－121．

［11］ 柏志全，李春英，李 媛，等．氯通道在华蟾酥毒基诱导的鼻咽癌细胞凋亡中起重要作用［J］．中国病理生理杂志，2011，27(5):833－837．

［12］ Weylandt KH，Nebrig M，Jansen－Rosseck N，et al．ClC－3 expression enhances etoposide resistance by increasing acidification of the late endocytic compartment［J］．Mol Cancer Ther，2007，6(3):979 －986．

［13］ Ise T，Shimizu T，Lee EL，et al．Roles of volume－sensitive Cl－channel in cisplatin－induced apoptosis in human epidermoid cancer cells［J］．J Membr Biol，2005，205(3):139－145．

［14］ Vaalburg W，Hendrikse NH，Elsinga PH，et al．P－glycoprotein activity and biological response［J］．Toxicol Appl Pharmacol，2005，207(2 Suppl):257 －260．