硫化氢对急性坏死性胰腺炎及相关肺损伤作用的初步探讨

饶春燕 付兰英 赵晓晏

硫化氢对急性坏死性胰腺炎及相关肺损伤作用的初步探讨

饶春燕 付兰英 赵晓晏

硫化氢(H2S)是一种小分子质量脂溶性气体分子，可以自由渗透入细胞膜发挥生物效应。在哺乳动物体内，以L-半胱氨酸为底物，通过激活5′-磷酸吡哆醛依赖性酶-胱硫醚-γ裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE，EC 4.4.1.1)和胱硫醚-β合成酶(cystathionine β-synthase, CBS，EC 4.2.1.22)生成H2S[1]。H2S在体内主要有2 种存在形式，约1/3以气体H2S形式存在，约2/3以NaHS (HS-)形式存在。大量证据显示[1-2]，H2S在调节血管、胃肠道、心肌收缩、神经传递和胰岛素分泌等方面起着重要的作用。本研究用炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PAG)抑制内源性H2S产生及给予外源性H2S载体(NaHS)，观察其对急性坏死性胰腺炎(ANP)胰腺及肺炎症浸润的影响，并探讨其机制。

一、材料与方法

1．大鼠模型建立及分组：66只6周龄SPF级SD雄性大鼠购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，体重202～243 g。按数字表法随机分为对照组(6只)、ANP组(10只)、PAG组(10只)及5、10、20、100 mg NaHS组(均10只)。参照赖铭裕等[3]方法，采用经腹腔注射6%左旋精氨酸溶液制备ANP模型。PAG组于建模前1 h经腹腔注射PAG 50 mg/kg体重，各NaHS组于建模前1 h经腹腔分别注射NaHS 5、10、20、100 mg/kg体重[4]。对照组以生理盐水代替左旋精氨酸。左旋精氨酸购自上海生物有限公司，PAG、NaHS购自Sigma公司。建模24 h后取血，取胰尾部及右肺下叶外1/3组织置3.7%甲醛溶液固定，其余胰及肺组织立即冻存于液氮。

2．血淀粉酶、IL-6、H2S的测定：采用自动生化仪检测血清淀粉酶活性，采用ELASA法检测血IL-6水平。H2S的检测参考文献[5]，先在试管中加入0.5 ml 10 g/L醋酸锌,然后加入0.1 ml血浆标本,振荡混匀,再依次加入0.5 ml 20 mmol/L对氨基二甲基苯胺盐酸盐和0.5 ml 30 mmol/L三氯醋酸,再加入2.5 ml蒸馏水补足体积至5 ml,充分混匀，6000 r/min离心5 min,取上清液,用分光光度计在670 nm处检测吸光值(A670值)。根据H2S标准曲线计算上清液中H2S的含量。

3．胰腺及肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性检测：将液氮冻存胰腺组织剪成小块，称重，加入9倍量的生理盐水置Dounce匀浆机，制成10%胰腺组织匀浆，按照MPO检测试剂盒(南京建成生物有限公司)说明书检测MPO活性。

4．胰腺及肺组织CSE mRNA表达检测：使用Trizol法提取胰腺及肺组织总RNA，应用cDNA合成盒(Fermentas公司)将总RNA逆转录为cDNA。引物序列：CSE-F 5′-TGGGACCAGAGCCGGAGCAA-3′，CSE-R 5′-AAGGCCCCGAGC-GAAGGTCA-3′；内参GAPDH-F 5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，GAPDH-R 5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′，引物由湖南远泰生物技术公司合成。于 ABI PCR Thermal Cycler实时定量PCR仪上进行PCR，扩增条件：95℃ 20 s，55℃ 20 s、72℃ 20 s，实时监测记录荧光强度，扩增完毕后进行熔解曲线分析。

二、结果

1．胰腺、肺组织学改变：对照组胰腺及肺脏无明显改变。ANP组胰腺叶、小叶间隔距离增宽，散在多发坏死灶，伴炎性细胞浸润，血管充血扩张；肺泡壁严重破坏，弥漫性充血，肺间质水肿，肺泡间隔增宽，大量中性粒细胞浸润。PAG组胰腺腺泡细胞片状出血、坏死，炎症细胞大量浸润，血管明显充血；肺间质大量中性粒细胞浸润，小支气管破坏严重，肺泡腔内大量红细胞。5 mg NaHS组病理改变与ANP组相似，随NaHS浓度增加，胰腺腺泡细胞坏死程度逐渐减轻，肺内出血量逐渐减少，炎性浸润逐渐较少(图1、2)。

图1对照组(a)、ANP组(b)、PAG组(c)及10、20、100 mg NaHS组(d、e、f)胰腺病理改变(×200)

图2对照组(a)、ANP组(b)、PAG组(c)及10、20、100 mg NaHS组(d、e、f)肺组织病理改变(×200)

2．血淀粉酶、IL-6、H2S水平的变化：ANP组血淀粉酶及IL-6水平均较对照组显著升高，H2S水平较对照组显著降低(P<0.01)。PAG组血淀粉酶及IL-6水平较ANP组进一步升高，H2S水平较ANP组进一步降低(P<0.01)。NaHS组血淀粉酶及IL-6水平随NaHS浓度升高逐渐降低，直至与对照组无显著差异；H2S浓度随NaHS浓度升高而升高，但仍显著低于对照组(P<0.01，表1)。

3．胰腺和肺组织MPO活性：ANP组胰腺和肺MPO活性均较对照组显著升高，PAG组的MPO活性又较ANP进一步升高(P值均<0.01)。NaHS组胰腺和肺MPO活性随NaHS浓度升高逐渐降低，但仍显著高于对照组(P<0.01，表1)。

4．胰腺和肺组织CSE mRNA表达水平：ANP组胰腺和肺组织CSE mRNA水平较对照组明显降低，PAG组胰腺CSE mRNA表达较ANP组进一步降低(P<0.01)，而肺组织CSE mRNA表达与ANP组无显著差异。NaHS组胰腺和肺组织CSE mRNA水平随NaHS浓度升高逐渐升高，在100 mg NaHS组，胰腺CSE mRNA水平与对照组无明显差异，但肺组织CSE mRNA水平仍显著低于对照组(P<0.01,表1)。

讨论文献报道，H2S供体(NaHS)能抑制由阿司匹林引起的白细胞黏附及白细胞和内皮细胞黏附分子LFA-1、ICAM-1表达上调[6]，能显著减少中性粒细胞在肝、肺组织中的聚集[7]。Li等[8]通过尾静脉注射油酸诱导大鼠急性肺损伤模型，给予NaHS可增加PaO2，增加IL-10水平，降低肺湿干重比和多形核白细胞浸润，减轻肺损伤程度；同时降低血浆和肺组织中IL-6和IL-8水平。Tripatara等[9]报道, 给予缺血再灌注损伤大鼠NaHS可明显降低组织损伤程度，减少再灌注组织中MAPK磷酸化，降低caspase-3活化水平，下调Bcl-2和NF-κB依赖蛋白(iNOS、COX2、ICAM-1)的表达[9]，而PAG则能加剧上述反应。Tamizhselvi等[10]用雨蛙肽体外孵育胰腺腺泡细胞, 结果显示蛋白激酶B(AKT)磷酸化减少、IκBα降解增加、NF-κB活性、TNF-α和IL-1β表达均升高；同时加入NaHS，则胰腺腺泡细胞的AKT磷酸化增加、IκBα降解减少、NF-κB活性及TNF-α、IL-1β表达均降低。

表1 各组血清淀粉酶、血浆H2S浓度、IL-6水平及胰腺和肺组织MPO活性、CSE mRNA表达

注：与对照组比较，aP<0.05；bP<0.01；与ANP组比较，cP<0.05，dP<0.01

本结果显示，诱发ANP后，大鼠血H2S浓度明显下降，胰腺和肺组织CSE mRNA表达下调。给予CSE抑制剂PAG抑制内源性H2S生成后，胰腺和肺损伤及炎症浸润程度进一步加重；给予外源性H2S(NaHS)后，H2S浓度升高，胰腺和肺组织CSE mRNA表达上调，胰腺和肺损伤程度减轻，提示CSE/H2S体系的下调参与ANP 的发病过程。

IL-6是一种重要的急性反应期炎症介质，血IL-6水平有助于早期判断急性胰腺炎病情的严重程度[11]。本结果显示，ANP大鼠血浆IL-6水平明显升高，给予PAG后进一步升高，而给予NaHS后IL-6水平逐渐下降，表明H2S可以通过抑制IL-6的产生减轻ANP炎症损伤程度，但其作用有限。

[1] Moore PK, Bhatia M, Moochhala S. Hydrogen sulfide: from the smell of the past to the mediator of the future? Trends Pharmacol Sci, 2003, 24: 609-611.

[2] Bhatia M. Hydrogen sulfide as a vasodilator. IUBMB Life, 2005, 57:603-606.

[3] 赖铭裕, 梁志海, 唐国都,等. 腹腔注射左旋精氨酸诱导急性坏死性胰腺炎大鼠模型. 世界华人消化杂志, 2006, 14:2233-2236.

[4] Sidhapuriwala JN, Ng SW, Bhatia M. Effects of hydrogen sulfide on inflammation in caerulein-induced acute pancreatitis. J Inflamm(Lond), 2009, 6:35.

[5] Chunyu Z, Junbao D, Dingfang B, et al. The regulatory effect of hydrogen sulfide on hypoxic pulmonary hypertension in rats. Biochem Biophys Res Commun, 2003,302:810-816.

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[8] Li T, Zhao B, Wang C, et al. Regulatory effects of hydrogen sulfide on IL-6, IL-8 and IL-10 levels in the plasma and pulmonary tissue of rats with acute lung injury. Exp Biol Med, 2008, 233:1081-1087.

[9] Tripatara P, Pate NS, Collino M, et al. Generation of endogenous hydrogen sulfide by cystathionine gamma-lyase limits renal ischemia/reperfusion injury and dysfunction. Lab Invest, 2008, 88:1038-1048.

[10] Tamizhselvi T, Sun J, Koh YH, et al. Effect of hydrogen sulfide on the phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B pathway and on caerulein-induced cytokine production in isolated mouse pancreatic acinar cells. J Pharmacol Exp Ther, 2009, 329:1166-1178.

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.018

400037 重庆，第三军医大学新桥医院消化内科

赵晓晏，Email：zhaoxx@medmail.com.cn

2011-03-21)

(本文编辑：屠振兴)