STAT3调控胰腺癌侵袭转移相关基因的筛选

李海东 裘正军 黄陈 江弢 曹俊

·论著·

STAT3调控胰腺癌侵袭转移相关基因的筛选

李海东 裘正军 黄陈 江弢 曹俊

目的应用基因芯片筛选信号转导与转录激活因子3(STAT3)调控胰腺癌侵袭转移的相关基因。方法以慢病毒感染获得稳定STAT3沉默人胰腺癌细胞株SW1990，以空质粒病毒组、未感染组为对照。应用基因芯片筛选3组细胞与肿瘤侵袭转移相关的差异表达基因。用实时PCR及蛋白质印迹法检测STAT3 mRNA及蛋白表达，并验证所选取的3个差异表达基因(MMP-7、IL-1β、IgTα7)。结果靶向STAT3的病毒感染SW1990细胞后，STAT3 mRNA表达水平为0.391±0.037，显著低于空质粒病毒组的1.002±0.015和未感染组的1.206±0.042(P<0.05)；STAT3蛋白表达水平为182.38±65.32，亦明显低于空质粒病毒组的223.40±58.40和未感染组的212.33±53.69(P<0.05)。STAT3沉默的SW1990细胞有8个肿瘤侵袭转移相关基因表达上调，3个表达下调，经验证，沉默组细胞MMP-7、IL-1β mRNA表达水平明显低于空质粒病毒组(0.287±0.115比1.010±0.124，t=19.45，P=0.000；0.490±0.010比1.002±0.002，t=13.83，P=0.000)，而IgTα7 mRNA表达水平无明显变化(1.173±0.280比0.998±0.003，t=4.236，P=0.094)。同时沉默组细胞MMP-7蛋白表达亦显著降低。结论STAT3沉默可导致人胰腺癌SW1990细胞多个与肿瘤侵袭转移相关基因表达的改变，其中MMP-7可能是受STAT3调控的主要靶基因。

胰腺肿瘤； STAT3转录因子； 肿瘤转移； 基因

信号转导与转录激活因子3是信号转导与转录激活因子家族(signal transducers and activators of transcription, STAT)的成员之一，在多种实体瘤组织中高表达，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭转移密切相关。STAT3可调控与细胞增殖、肿瘤血管形成相关的多个基因[1]。胰腺癌组织STAT3过表达，并与癌细胞的侵袭及转移相关[2-3]，但其作用机制尚不清楚。本研究应用基因芯片技术筛选STAT3调控的侵袭转移相关基因，探索STAT3介导胰腺癌侵袭转移的分子机制。

材料与方法

一、靶向STAT3的shRNA载体构建、慢病毒包装、SW1990细胞转染及鉴定

构建慢病毒载体的pGC-LV 重组载体、pHelper1.0、pHelper2.0均购自吉凯基因化学有限公司，人胰腺癌细胞株SW1990购自ATCC，293T细胞购自Invitrogen公司。载体构建、慢病毒包装、SW1990细胞感染及鉴定方法参照我们发表的文献[4]。以含空质粒病毒感染及未感染的SW1990细胞作为对照。

二、实时PCR基因芯片检测

采用Trozol试剂裂解细胞后抽提RNA。紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度，变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及完整性。按照逆转录酶使用说明，将样本RNA逆转录成cDNA。将cDNA模板适当稀释后加入到实时PCR反应液中，混合后加入SuperArray Bioscience公司的RT2Profiler Human Tumor Metastasis PCR Array(PAHS-028A，内含肿瘤侵袭转移相关基因89个,5个管家基因)于对应的每个孔中。上ABI PRISM7900型PCR仪进行实时定量PCR反应。数据计算采用ΔΔCt法，以差异为两倍作为筛选标准。

三、实时PCR检测相关基因mRNA表达

引物序列：STAT3上游5′-GGCGGCACCACC-ATGTACCCT-3′，下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCAT-ACT-3′，产物202 bp；基质金属蛋白酶7(MMP-7)上游5′-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3′，下游5′-AAATGCAGGGGGATCTCTTT-3′，产物169 bp；白介素-1β(IL-1β)上游5′-CTGAGCTCGCCAGTGAA-3′，下游5′-GGTCTGTGGGCAGGGAA-3′，产物239 bp；整合素α7(IgTα7)上游5′-GCGGCCACTCGGTCTGTG-TGGAC-3′，下游5′-GGAGACTGTAGGACAAGG-TCAC-3′，产物303 bp；β-actin上游5′-TCACCC-ACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游5′-CAGCGG-AACCGCTCATTGCCAATGG-3′，产物294 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR参数：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s， 40个循环。数据计算采用ΔΔCt法，以空质粒病毒组为1。实验重复3次，取均值。

四、蛋白质印迹法检测STAT3及MMP-7蛋白表达

取各组4×106个细胞，PBS洗涤，加冰浴预冷的RIPA裂解液200 μl及蛋白酶抑制剂2 μl置4℃充分裂解15 min，4℃ 12 000 g离心15 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度。常规行蛋白质印迹法。STAT3抗体购自Cell Signal公司，MMP-7抗体购自R&D System公司。最后ECL发光后曝光2 min。分别以GADPH、β-actin蛋白作为内参照。目的条带与内参条带的灰度比值表示蛋白相对表达量。

五、ELISA法检测IL-1β蛋白

取各组细胞，采用ELISA试剂盒(新博盛生物科技有限公司)检测IL-1β含量，按说明书操作。

六、统计学处理

结 果

一、STAT3的沉默效果

靶向STAT3病毒感染(STAT3沉默)组、空质粒病毒组、未感染组细胞的STAT3 mRNA表达水平分别为0.391±0.037、1.002±0.015、1.206±0.042，STAT3沉默组明显低于空质粒病毒组(t=16.31，P=0.004)及未感染组(t=18.82，P=0.003)，后两组差异无统计学意义(t=3.25，P=0.083)；STAT3蛋白的表达水平分别为182.38±65.32、223.40±58.40、212.33±53.69(图1)， STAT3沉默组明显低于空质粒病毒组及未感染组(P<0.05)，表明STAT3基因被沉默。

图1 各组细胞的STAT3蛋白表达

二、PCR基因芯片筛选结果

经基因芯片筛选，STAT3沉默的SW1990细胞中，与肿瘤侵袭转移相关的基因有8个表达上调，分别为基质金属蛋白酶(MMP)-3、-10、-11，白介素-8β型受体亚基(IL-8Rβ)，钙黏附蛋白11(CDH-11)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂7(CST-7)，脾酪氨酸激酶(SYK)，v-myc髓细胞组织增生病毒癌基因同源物1(MYCL1)，上调了10.88、19.93、4.59、7.06、2.01、3.34、3.38、4.85倍；3个表达下调，分别为MMP-7、整合素α7(IgTα7)及IL-1β，下调了2.54、5.39、23.90倍。

三、表达差异基因的验证

STAT3沉默组、空质粒病毒组、未感染组MMP-7 mRNA表达水平分别为0.287±0.115、1.010±0.124、0.857±0.307，STAT3沉默组明显低于空质粒病毒组及未感染组(t=19.45，P=0.000；t=3.20，P=0.033)，后两组差异无统计学意义(t=-0.79，P=0.47)，基本符合芯片结果；IL-1β mRNA表达水平分别为0.490±0.010、1.002±0.002、1.030±0.20，STAT3沉默组亦明显低于空质粒病毒组及未感染组(t=13.83，P=0.000；t=4.60，P=0.01)，后两组差异无统计学意义(t=0.181，P=0.873)；IgTα7 mRNA表达水平分别为1.173±0.280、0.998±0.003、1.360±0.044,3组间差异无统计学意义(t=4.236，P=0.094)。

STAT3沉默组MMP-7蛋白表达明显低于空质粒病毒组及未感染组(图2)。STAT3沉默组、空质粒病毒组、未感染组细胞培养上清液中IL-1β浓度分别为(20.00±0.65)、(22.69±3．18)、(24.83±4.43)pg/ml，STAT3沉默组低于空质粒病毒组及未感染组，但差异无统计学意义(P=0.225，P=0.135)。空质粒病毒组及未转染组间差异亦无统计学意义(P=0.533)。

图2 各组细胞的MMP-7蛋白表达

STAT3是信号转导与转录激活因子家族成员之一，介导多种细胞因子和生长因子的信号转导。STAT3在接受细胞外信号刺激后，通过酪氨酸磷酸化激活，活化的STAT3形成二聚体进入细胞核，调节靶基因转录，在肿瘤细胞增殖和侵袭转移中起重要作用，目前已被公认为癌基因。已有研究证实，STAT3可上调MMP-1、-2、-9、血管内皮生长因子(VEGF)等基因的表达，降解细胞外基质，促进肿瘤新生血管形成及癌细胞的侵袭和转移[5-6]。将靶向STAT3的siRNA转染SW1990后，细胞增殖、侵袭能力明显减弱。Xie等[7]研究发现，应用显性负性突变的方法抑制STAT3活性可明显降低MMP-2的表达，使肿瘤侵袭性降低。Rivat等[8]报道，阻断STAT3β可明显下调VEGF，抑制结肠癌细胞的浸润转移。

MMP-7是MMP家族中分子量最小的亚族，具有强大的基质降解功能和广泛的底物特异性，近年来逐渐受到人们的关注。肿瘤组织MMP-7的表达增强，参与基底膜和细胞外基质胶原蛋白的降解，使肿瘤细胞易于突破基底膜和细胞外基质向邻近器官浸润，并侵入淋巴管及小血管向远处转移。MMP-7对病理条件下血管内皮细胞的增生、毛细血管的形成具有促进作用[9]。研究表明，胰腺癌组织MMP-7呈高表达，并与肿瘤侵袭转移密切相关[10]。Li等[11]发现，β-catenin可通过上调MMP-7的表达提高胰腺癌的转移能力。最近有关乳腺癌和胃癌的研究证实肿瘤组织中MMP-7受AP-1和STAT3的直接调控，并影响肿瘤的侵袭转移[11-12]。

本结果显示，STAT3沉默后，有8个肿瘤侵袭转移相关基因表达上调，3个基因表达下调。鉴于STAT3转录因子的特性，我们选取3组间变化比较一致的基因MMP-7、IL-1β、IgTα7进一步验证，发现STAT3沉默后，SW1990细胞的MMP-7、IL-1β mRNA水平均明显下降，证实了基因芯片的结果。但IgTα7mRNA表达在3组间无明显变化。MMP-7蛋白的表达显著下降，但细胞培养上清液的IL-1β含量无显著变化，提示STAT3可能通过改变多个基因的表达促进胰腺癌侵袭及转移。而MMP-7可能是受STAT3调控的主要靶基因。

[1] Ernst M, Phesse T, Jenkins B, et al. Linking inflammation to cancer-A novel role for Stat3. Cytokine, 2010, 48:44.

[2] Wei D, Le X, Zheng L, et al. Stat3 activation regulates the expression of vascular endothelial growth factor and human pancreatic cancer angiogenesis and metastasis. Oncogene, 2003,22:319-329.

[3] Huang C, Cao J, Huang KJ,et al. Inhibition of STAT3 activity with AG490 decreases the invasion of human pancreatic cancer cells in vitro. Cancer Sci, 2006, 97:1417-1423.

[4] Yang G, Huang C, Cao J, et al. Lentivirus-mediated shRNA interference targeting STAT3 inhibits human pancreatic cancer cell invasion. World J Gastroenterol, 2009,15:3757-3766.

[5] Itoh M, Murata T, Suzuki T, et al. Requirement of STAT3 activation for maximal collagenase-1(MMP-1)induction by epidermal growth factor and malignant characteristics in T24 bladder cancer cells. Oncogene, 2006,25: 1195-1204.

[6] 黄陈，裘正军，孙晶，等. p-STAT3与MMP-2、MMP-9在胰腺癌组织中表达及其临床意义.中华肝胆外科杂志，2007，13：851-853.

[7] Xie TX, Wei D, Liu M, et al. Stat3 activation regulates the expression of matrix metalloproteinase-2 and tumor invasion and metastasis. Oncogene, 2004,23: 3550-3560.

[8] Rivat C, Rodrigues S, Bruyneel E, et al. Implication of STAT3 signaling in human colonic cancer cells during intestinal trefoil factor 3 (TFF3)-and vascular endothelial growth factor-mediated cellular invasion and tumor growth. Cancer Res, 2005,65:195-202.

[9] Nishizuka I, Ichikawa Y, Ishikawa T, et al. Matrilysin stimulates DNA synthesis of cultured vascular endothelial cells and induces angiogenesis in vivo. Cancer Lett,2001,173:175-182.

[10] Tan X, Egami H, Abe M,et al. Involvement of MMP-7 in invasion of pancreatic cancer cells through activation of the EGFR mediated MEK-ERK signal transduction pathway. J Clin Pathol, 2005,58:1242-1248.

[11] Li YJ, Wei ZM, Meng YX, et al. Beta-catenin up-regulates the expression of cyclinD1, c-myc and MMP-7 in human pancreatic cancer: relationships with carcinogenesis and metastasis. World J Gastroenterol,2005,11:2117-2123.

[12] Adachi Y, Li R, Yamamoto H, et al. Insulin-like growth factor-I receptor blockade reduces the invasiveness of gastrointestinal cancers via blocking production of matrilysin. Carcinogenesis,2009,30:1305-1313.

ScreeningofinvasionandmetastasisrelatedgenesregulatedbyStat3inpancreaticcancerSW1990cell

LIHai-dong,QIUZheng-jun,HUANGChen,JIANGTao,CAOJun.
DepartmentofGeneralSurgery,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China

QIUZheng-jun,Email:qiuwryb@online.sh.cn

ObjectiveTo screen the genes related with signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3) regulating pancreatic cancer invasion and metastasis by gene chips.MethodsHuman pancreatic cancer cell line SW1990 stably expressing low level of Stat3 was established by lentivirus transfection, while cells transfected with mock plasmid and cells without transfection served as control groups．The differences of invasion and metastasis related genes expression among the three groups were screened by gene chips．STAT3 mRNA and protein expression was measured by real-time PCR and Western blot．Three differentially expressed genes (MMP-7, IL-1β and IgTα7) were verified.ResultsThe expression level of STAT3 mRNA was 0.391±0.037 after pancreatic cancer SW1990 cell transfected with STAT3 targeted lentivirus, which was significantly lower than those in mock plasmid group (1.002±0.015) and non-transfected group (1.206±0.042,P<0.05)；the expression level of STAT3 protein was 182.38±65.32, which was significantly lower than those in mock plasmid group (223.40±58.40) and non-transfected group (212.33±53.69). Eight invasion and metastasis related genes of SW1990 lowly expressing Stat3 were up-regulated, while 3 genes were down-regulated．By verification, the mRNA level of MMP-7 and IL-1β were lower than in control group transfected with mook plassmid(0.287±0.115vs1.010±0.124,t=19.45,P=0.000;0.490±0.10vs1.002±0.002,t=13.83,P=0.000), but the mRNA level of IgTα7 was not decreased(1.173±0.280vs0.998±0.003,t=4.236,P=0.094). Meanwhile, the protein level of MMP-7 was significantly down-regulated when Stat3 was knocked down.ConclusionsStat3 causes changes of expressions of many invasion and metastasis-related genes of SW1990, and MMP-7 may be the main target gene regulated by Stat3.

Pancreatic neoplasms； STAT3 transcription-factor; Neoplasm metastasis； Genes

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.009

上海市科学技术委员会青年科技启明星项目(09QA1404600)

200080 上海，上海交通大学附属第一人民医院普外科

裘正军,Email:qiuwryb@online.sh.cn

2011-06-13)

(本文编辑：吕芳萍)