Smad7反义寡核苷酸对人胰腺癌SW1990细胞MMP-2和TIMP-2表达及细胞增殖的影响

于鸿 黄俊星 王朝夫 施达仁

·论著·

Smad7反义寡核苷酸对人胰腺癌SW1990细胞MMP-2和TIMP-2表达及细胞增殖的影响

于鸿 黄俊星 王朝夫 施达仁

目的研究Smad7反义寡核苷酸(ASODN)转染后人胰腺癌SW1990细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)表达及细胞增殖的变化，探讨Smad7在胰腺癌发生、发展中的作用机制。方法经脂质体介导将Smad7 ASODN转染人胰腺癌细胞株SW1990。以无义寡核苷酸(NSODN)转染、单加ASODN、单加脂质体作为对照。荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率； RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染细胞Smad7、MMP-2和TIMP-2表达；噻唑蓝(MTT)比色法检测转染细胞的增殖。结果Smad7 ASODN转染SW1990细胞的转染效率为81.2%，转染24 h后，转染组、ASODN组和脂质体组细胞Smad7 mRNA表达量分别为0.34±0.06、0.95±0.07、1.03±0.11；MMP-2 mRNA表达量为0.54±0.08、1.15±0.13、1.27±0.16； TIMP-2 mRNA表达量为0.26±0.07、0.72±0.13、0.78±0.17；Smad7蛋白表达量为0.14±0.03、0.29±0.05、0.28±0.07； MMP-2蛋白表达量为0.17±0.02、0.29±0.05、0.31±0.04；TIMP-2蛋白表达量为0.20±0.03、0.41±0.11、0.43±0.09。转染组均较其他各组的表达显著减少(P值均<0.01)。转染组、ASODN组、脂质体组细胞的增殖活性分别为0.83±0.03、1.02±0.02、0.99±0.02，转染组细胞的增殖活性较其他各组显著被抑制(P值均<0.01)。结论Smad7 ASODN转染可有效抑制SW1990细胞Smad7基因的表达，并抑制MMP-2、TIMP-2表达及细胞增殖活性。

胰腺肿瘤； Smad7； 反义寡核苷酸； 基质金属蛋白酶-2； 基质金属蛋白酶组织抑制因子-2； 细胞增殖

研究表明，TGF-β/Samds信号转导通路的异常在胰腺癌的发生、发展过程中具有重要作用。半数以上的胰腺癌有TGF-β/Samds信号通路异常，其发生机制主要包括Samds基因家族突变和表达异常，也涉及TGF-β超家族及其受体的改变[1]。然而，作为TGF-β/Samds信号通路的负调控因子Smad7基因在胰腺癌发生、发展中的作用研究甚少。本实验将Smad7反义寡核苷酸(ASODN)转染胰腺癌细胞株SW1990，观察转染后细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)表达及细胞增殖的变化，进一步阐明Smad7在胰腺癌侵袭和转移中的作用。

材料和方法

一、细胞培养及转染

人胰腺癌细胞株SW1990由复旦大学附属肿瘤医院中西医结合科刘鲁明教授馈赠，常规培养、传代。取对数生长期细胞，以5×105个/孔密度接种于6孔板。待细胞生长至60%～70%融合时，采用脂质体法将Smad7 ASODN、无义寡核苷酸(NSODN)转染SW1990细胞。ASODN序列为5′-AAGATAATTCGTTCCCCCTGTCCTGTCTC-3′,NSODN序列为5′-CATTTCTTGCTCTCCACGTGGTGTAGACA-3′，首尾3个磷酸键硫化修饰，5′端标记异硫氰酸荧光素(FITC)，均由上海生工有限公司合成，Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司，按说明书操作。以单加ASODN、单加脂质体、单加培养液作为对照。转染24 h后收集各组细胞，部分行细胞爬片后甲醛固定，荧光显微镜下观察细胞内带荧光的ASODN的分布。部分细胞重悬后用流式细胞仪检测转染效率。

二、Smad7、MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白检测

取转染24、48 h细胞，用Trizol抽提总RNA，应用Advantage cDNA PCR试剂盒(Gibco公司)行RT-PCR。Smad7序列上游5′-CCCATCTTCATCAAGTCCG-3′，下游5′-GCTGTAGGCTTTCTCATAGTCA-3′，扩增片段335 bp；MMP-2上游5′-CTCAGCGGCTCATGGTCC-GGCC-3′，下游5′-CATGGTCCGGCCCCCGCCCCCA-3′，扩增片段278 bp；TIMP-2上游5′-CTGTCC-CCTCBCCTCTTCGC-3′，下游5′-TCCACCTCCTTC-TCGCTCACTG-3′，扩增片段303 bp；内参GAPDH上游5′-ACCACAGTCCATGCCATG-CCATCAC-3′，下游5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，扩增片段450 bp，均由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应条件：94℃ 5或7 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min，共33个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，Kodak Digital Science 1D扫描，以目的条带与内参条带的灰度比值表示mRNA表达量。

取各组标本，按本实验室方法提取蛋白[2]，常规行蛋白质印迹法。以β-actin为内参。兔抗人Smad7、鼠抗人MMP-2及TIMP-2多抗均购于DAKO公司。以目的条带与内参条带的灰度比值表示蛋白表达量。

三、细胞增殖活性检测

取各组指数生长期细胞，以1×104个细胞数接种于96孔板中，每组6个复孔。培养24、48、72 h后分别每孔加入噻唑蓝(MTT，5 mg/ml)20 μl再培养4 h，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)震荡10 min，测各孔490 nm处吸光值(A)，取均值。

四、统计学分析

结 果

一、转染效率

转染24 h后，转染组细胞内可见大量绿色荧光，呈离散型、点状分布，转染效率为81.2%；ASODN组仅少量细胞见微弱荧光，转染效率为3.1%；NSODN组及脂质体组细胞内均未见荧光(图1)，故以下实验数据省略NSODN组。

图1转染组(a)、ASODN组(b)、脂质体组(c)转染效率 上图：荧光显微镜检(×200) 下图：流式细胞仪检测

二、细胞Smad7 mRNA及蛋白表达

转染组细胞Smad7 mRNA及蛋白表达均显著低于ASODN组，但转染24 h和48 h组间差异无统计学意义；ASODN组和脂质体组间差异无统计学意义(图2，表1)。

图2各组细胞的Smad7 mRNA(上)及蛋白(下)表达

表1 各组细胞Smad7 mRNA及蛋白表达的变化

注：转染24、48 h组与ASODN组比较，t值分别为：24.287、 16.572、13.141、15.833，aP<0.05

三、细胞MMP-2、TIMP mRNA及蛋白表达

转染24 h组细胞MMP-2、TIMP mRNA及蛋白表达均显著低于ASODN组，ASODN组和脂质体组间差异无统计学意义(表2，图3、4)。

组 别MMP⁃2mRNAMMP⁃2蛋白转染24h组0．54±0．08a0．17±0．02aASODN组1．15±0．130．29±0．05脂质体组1．27±0．160．31±0．04组 别TIMP⁃2mRNATIMP⁃2蛋白转染24h组0．26±0．07a0．20±0．03aASODN组0．72±0．130．41±0．11脂质体组0．78±0．170．43±0．09

注：转染24 h组与ASODN组比较，t值分别为11.308、7.262、 18.733、10.465，aP<0.05

图3 各组细胞MMP2 mRNA(上)及蛋白(下)表达

四、细胞增殖活性

转染24、48、72 h后，细胞的增殖活性均较ASODN组降低，以转染后24 h最为明显，ASODN组和脂质体组间差异无统计学意义(表3)。

表3 各组细胞的增殖活性(A490值

注：转染组与ASODN组比较，t值分别为9.832、9.758、9.549，aP<0.05

讨 论

TGF-β信号转导通路是由TGF-β超家族、TGF-β受体、Smad蛋白家族及其核内转录调节因子组成的肿瘤抑制通路，该通路的异常可使细胞逃避TGF-β介导的生长抑制效应，导致多种肿瘤发生[3-4]。不同类型的细胞TGF-β诱导产生的生物学效应不同，可刺激或抑制细胞生长，可作为肿瘤抑制基因和癌基因的双重角色存在[5]。作为Smad家族中的抑制性成员，Smad7不仅可阻断Smad2和Smad3与Ⅰ型TGFβ-R的结合及其磷酸化，还可通过直接与活化的TGFβ-R及细胞内各转录因子组氨酸去乙酰基酶结合而抑制TGF-β的信号通路[6]。研究表明，胰腺癌组织Smad7表达增高；转染Smad7基因的胰腺癌细胞在裸鼠中成瘤能力增强，表明Smad7表达的异常将有助于肿瘤的发生、发展[7]。Kleeff等[8]通过显微注射技术获得转Smad7基因小鼠，发现转基因小鼠胰腺的导管上皮发生了恶性转变。

基质金属蛋白酶系统，包括MMPs及相应的TIMPs。其中MMPs的表达增加与多种恶性肿瘤的侵袭和转移关系极为密切，而TIMPs的表达增加往往与肿瘤侵袭能力下降及患者的预后较好相关[9]。

本研究成功地将Smad7基因转染入SW1990细胞，转染率高达81.2%，有效地抑制Smad7表达，并显著地抑制了细胞的增殖。同时细胞MMP-2及TIMP-2表达均显著降低，表明Smad7也参与细胞基质金属蛋白酶系统的代谢过程。至于转染后SW1990细胞MMP-2与TIMP-2表达共同降低，可能它们之间还存在一定反馈机制，有待今后进一步深入研究。

[1] Glasgow E,Mishra L.Transforming growth factor-beta signaling and ubiquitinators in cancer.Endocr Relat Cancer,2008,15:59-72.

[2] 于鸿，陈琦，刘晔，等.转染Smad7基因的大鼠肾小球系膜细胞对Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的改变.复旦学报·医学版，2008，35：436-440.

[3] Elliott RL,Blobe GC.Role of transforming growth factor Beta in human cancer.J Clin Oncol,2005,23:2078-2093.

[4] Muraoka-Cook RS,Dumont N,Arteaga CL.Dual role of transforming growth factor beta in mammary tumorigenesis and metastatic progression.Clin Cancer Res,2005,11:937s-943s.

[5] 钟良，陈坚，徐近，等.胰腺癌组织中转化生长因子β1及其Ⅰ型受体的表达及意义.中华消化杂志，2008，28：94-96.

[6] Fleisch MC,Maxwell CA,Barcellos-Hoff MH. The pleiotropic roles of transforming growth factor beta in homeostasis and carcinogenesis of endocrine organs.Endoc Relat Cancer,2006,13: 379-400.

[7] Yan X,Liu Z,Chen Y.Regulation of TGF-beta signaling by Smad7.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2009,41:263-272.

[8] Kleeff J,Ishiwata T,Maruyama H,et al.The TGF-beta signaling inhibitor Smad7 enhances tumorigenicity in pancreatic cancer.Oncogene,1999,18:5363-5372.

[9] Kuang C,Xiao Y,Liu X,et al.In vivo disruption of TGF-beta signaling by Smad7 leads to premalignant ductal lesions in the pancreas.Proc Natl Acad Sci USA,2006,103:1858-1863.

EffectofSmad7antisenseoligodeoxynucleotideontheexpressionofMMP-2,TIMP-2andproliferationinhumanpancreaticcancercellsSW1990

YUHong,HUANGJun-xing,WANGChao-fu,SHIDa-ren.
DepartmentofPathology,TaizhouPeople′sHospital,Taizhou225300,China

HUANGJun-xing,Email:huangjunxing@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the effect of Smad7 antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) on proliferation in human pancreatic cancer cell line SW1990, with a focus on the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-2(TIMP-2). To explore the underlying mechanism of the role of Smad7 in the pathogenesis and development of pancreatic cancer.MethodsSmad7 ASODN was transfected into SW1990 cells through lipofectamine. Nosense oligodeoxynucleotide (NSODN), ASODN and lipofectamine was used as control. The transfection efficiency was assessed by fluorescence microscopy and flow cytometry. The expressions of Smad7, MMP-2 and TIMP-2 in transfected cells were detected by RT-PCR and Western blot. Cell viability was assessed by dimethyl thiazoldiphenyltetrazoliumbromide (MTT) method.ResultsSmad7 was expressed in SW1990 cells. The transfection efficiency of SW1990 was 81.2%. The expressions of Smad7 mRNA were 0.34±0.06, 0.95±0.07, 1.03±0.11 in transfected group, ASODN and lipofectamine group; and the expressions of MMP-2 mRNA were 0.54±0.08, 1.15±0.13, 1.27±0.16; and the expressions of TIMP-2 mRNA were 0.26±0.07, 0.72±0.13, 0.78±0.17, the mRNA expressions were significantly reduced in Smad7 ASODN transfected group, compared with other two groups (P<0.01). The expressions of Smad7 protein were 0.14±0.03, 0.29±0.05, 0.28±0.07 in transfected group, ASODN and lipofectamine group; the expressions of MMP-2 protein were 0.17±0.02, 0.29±0.05, 0.31±0.04, and the expressions of TIMP-2 protein were 0.20±0.03, 0.41±0.11, 0.43±0.09, the protein expressions were significantly reduced in Smad7 ASODN transfected group, compared with other two groups (P<0.01). TheA490values of proliferation were 0.83±0.03, 1.02±0.02, 0.99±0.02 in transfected group, ASODN and lipofectamine group, the proliferation were significantly reduced in Smad7 ASODN transfected group, compared with other two groups (P<0.01).ConclusionsSmad7 ASODN could effectively inhibit the expressions of Smad7, therefore decrease the expressions of MMP-2, TIMP-2 and reduce the proliferation.

Pancreatic neoplasms; Smad7； Antisense oligodeoxynucleotide； Matrix metalloproteinase-2； Tissue inhibitor of metalloproteinase-2; Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.008

江苏省医学重点人才基金(RC2007036)

225300 江苏泰州，江苏省泰州市人民医院病理科(于鸿)，肿瘤科(黄俊星)；复旦大学附属肿瘤医院病理科(王朝夫、施达仁)

黄俊星，Email:huangjunxing@yahoo.com.cn

2011-06-16)

(本文编辑：吕芳萍)