清胰汤对急性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB p65表达的影响

王念林 张铁英 欧阳玉霞 杨元生 陈垦

·短篇论著·

清胰汤对急性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB p65表达的影响

王念林 张铁英 欧阳玉霞 杨元生 陈垦

急性胰腺炎(AP)为临床常见病，病情凶险，常引起全身炎症反应综合征(SIRS)，并最终导致多器官功能衰竭(MODS)。目前具体发病机制尚不明确，治疗仍以对症支持为主。因而探求AP发病机制对寻找有效的治疗方法意义重大。本研究观察清胰汤对AP大鼠胰腺NF-κB p65表达的影响。

一、材料与方法

1．实验动物分组：54只SD大鼠由广东省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2008-0002，雌雄不限，体重(200±10)g。按完全随机法分成对照组、AP组、清胰汤组。采用逆行胰胆管注射3%牛磺胆酸钠的方法[1]建立AP模型。清胰汤组于建模后立刻予清胰汤1 ml/100 g体重灌胃，每12 h给药一次；对照组仅开腹翻动胰腺数次即关腹，以生理盐水替代灌胃。

2．血清淀粉酶、IL-1和TNF-α测定：血清淀粉酶测定采用人工碘比色法；血清IL-1和TNF-α检测采用ELISA方法。

3．胰腺病理学检查及NF-κB p65检测：胰腺组织常规病理检查，盲法阅片，并根据Ozhan等[2]标准评分。胞质和(或)胞核呈黄色或棕黄色为阳性。高倍镜下随机取5个视野，计阳性细胞数百分比及染色强度。阳性细胞数：<5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分；无染色0分，浅黄色1分，黄色2分，棕黄色3分。两评分乘积0～1分为(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，>6分(+++)。

二、结果

1．血清淀粉酶、IL-1和TNF-α水平： AP组和清胰汤组血清淀粉酶、IL-1和TNF-α水平均高于对照组；AP组血清淀粉酶水平于24 h达到峰值，随后逐渐下降，予清胰汤治疗后，24 h和48 h血清淀粉酶明显降低，72 h后3组比较差异无统计学意义；清胰汤组血清IL-1和TNF-α较AP组明显降低，呈时效依赖性，以72 h下降最明显(表1)。

表1 各组血清淀粉酶、IL-1和TNF-α变化

注：与对照组比较，aP<0.05；与AP组比较，bP<0.05

2．胰腺病理组织学变化：对照组胰腺组织未见病理改变(图1a)；AP组大鼠胰腺可见出血、坏死，大量炎细胞浸润，腺泡结构模糊，部分腺泡胞核溶解或消失，残余腺泡肿胀，间质水肿(图1b)；而清胰汤组胰腺组织病理改变较AP组减轻(图1c)。各组胰腺病理评分见表2。

图1对照组(a)、AP组(b)和清胰汤组(c)大鼠胰腺组织病理改变(HE ×200)

表2 各组胰腺病理评分

注：与对照组比较，aP<0.05；与AP组比较，bP<0.05

3．胰腺NF-κB p65蛋白表达：对照组胰腺组织NF-κB p65微量表达，主要见于细胞质，呈浅黄色(图2a)；AP组各时间点NF-κB p65表达增强，呈棕黄色，部分细胞核也有表达(图2b)；清胰汤组胰腺腺泡染色较AP变浅，胰腺NF-κB p65免疫组化积分较AP明显降低(图2c，表3)。

图2 对照组(a)、AP组(b)和清胰汤组(c)胰腺NF-κB表达(×200)

表3 各组胰腺NF-κB p65免疫组化积分

注：与AP组比较，aP<0.05

讨论AP病程中氧自由基、白介素、TNF等细胞因子大量产生，并易导致SIRS和MODS。清胰汤为传统组方，具有通里攻下，减少肠源性感染与内毒素血症；活血化瘀，改善微循环，减轻各器官的缺血、缺氧，减少氧自由基的产生；清除氧自由基；抑制体内各种炎症因子的产生；诱导器官细胞凋亡，从而减轻器官坏死程度等作用[3]。本研究结果显示，应用清胰汤治疗后AP大鼠各种氧化应激因子、炎症因子明显降低，器官损伤程度改善。

研究发现[4]，TNF-α、IL-1等多种细胞因子及黏附分子在基因多肽水平上受到NF-κB p65调节。活化的NF-κB p65可单独或与其他转录因子协同参与上述炎症因子基因的诱导表达，在细胞因子瀑布样级联反应中起中心作用。在AP发生早期，多个器官可检测到NF-κB p65高表达，并参与多器官的病理损伤[5]。应用NF-κB p65活化选择性抑制剂NBD，可选择性靶向抑制NF-κB，明显减轻AP大鼠胰腺、肺等器官损伤[6]。近年研究发现[7-8]，活性氧ROS是激活NF-κB的重要中介分子，因此抗氧化剂作为NF-κB抑制剂被深入研究。

本实验再次验证了清胰汤在AP模型大鼠中显示出良好的治疗效果。与AP组比较，清胰汤24 h和48 h血清淀粉酶明显降低，72 h接近正常水平，提示清胰汤能有效降低血清淀粉酶。炎症介质TNF-α、IL-1在AP发生、发展过程中发挥着重要作用，本研究发现二者升高明显。应用清胰汤治疗后大鼠血清TNF-α、IL-1水平于48 h和72 h较AP组下降明显，提示清胰汤可抑制炎症反应，减少炎症介质的产生和释放。本结果显示，AP大鼠胰腺NF-κB p65表达在建模后有不同程度升高，与血清中TNF-α、IL-1升高及胰腺病理损伤相平行，应用清胰汤灌胃治疗，降低了血清TNF-α、IL-1水平，并下调胰腺NF-κB p65的表达，改善其病理损伤。

综上所述，中药清胰汤对AP的治疗是通过多靶点作用实现的 ，其可能机制是通过抑制炎症通路中炎症相关蛋白的表达，从而达到保护器官目的。本研究得出，AP发生、发展涉及NF-κB p65等炎症相关因子的激活，产生并释放过度炎症介质介导过度炎症反应造成各器官的损伤；清胰汤可抑制AP大鼠体内过度炎症反应，降低TNF-α、IL-1水平，下调胰腺NF-κB p65表达，从而起到保护胰腺的治疗效果。

[1] 王念林，陈垦，龙友明，等.核因子-κB在大鼠急性坏死性胰腺炎中作用的实验研究.胰腺病学，2005,5：93-96.

[2] Ozhan G, Yanar HT, Ertekin C, et al. Polymorphisms in tumour necrosis factor alpha (TNFalpha) gene in patients with acute pancreatitis. Mediators Inflamm, 2010, 2010:482950.

[3] Yang DY, Duan SB, Aili JT. Effect of qingyi decoction in treating severe acute pancreatitis and its impacts on blood level of tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6 and interleukin-8. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2009, 29:1122-1124.

[4] Viterbo D, Bluth MH, Mueller CM, et al. Mutational characterization of pancreatitis-assiociated protein 2 domains involved in mediating cytokine secretion in macrophages and the NF-kappaB pathway. J Immunol, 2008, 181:1959-1968.

[5] Wang YL, Zheng YJ, Zhang ZP, et al. Effects of gut barrier dysfunction and NF-kappaB activation on aggravating mechanism of severe acute pancteatitis. J Dig Dis, 2009,10:30-40.

[6] Long YM, Chen K, Liu XJ, et al. Cell-permeable Tat-NBD peptide attenuates rat pancreatitis and acinus cell inflammation response. World J Gastroenterol, 2009, 15:561-569.

[7] KanSH,Huang F,Tang J,et al.role of intrapulmonary expression of inducible Nitric oxide synthase gene and nuclear factor kappaB activation in severe pancreatitis-assosiated lung injury. Inflammation,2010,33:287-294.

[8] Szabolcs A, Biczó G,Rakonczay Z, et al.simultaneous proteosome inhibition and heat shock protein induction by bortezomib is beneficial experimental pancreatitis. Eur J Pharmacol,2009,616:270-274.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.019

2010年广州市花都区医药卫生科技计划项目(HD10WSY17)

510800 广东广州，广州市花都区人民医院消化内科(王念林、张铁英、欧阳玉霞)；广东药学院附属第一医院消化内科(杨元生、陈垦)

陈垦Email:chken@gdpc.edu.cn

2011-02-22)

(本文编辑：屠振兴)