乌司他丁对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障的保护作用

曹洪庆 黄鹤光 陈燕昌 李洪森

·论著·

乌司他丁对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障的保护作用

曹洪庆 黄鹤光 陈燕昌 李洪森

目的观察乌司他丁干预急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠后血TNF-α、二胺氧化酶(DAO)及肠黏膜组织紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)表达水平的变化，探讨其可能机制。方法按完全随机法将SD雄性大鼠随机分为假手术组、ANP组及乌司他丁组。采用5%牛磺胆酸钠逆行注入胆胰管的方法制模。制模后6、24 h取血检测TNF-α、DAO活性，胰腺及回肠组织常规病理检查，RT-PCR及免疫组化法检测回肠组织ZO-1 mRNA及蛋白的表达。结果术后6 h，ANP组胰腺大片坏死，大量炎细胞浸润；回肠黏膜绒毛上皮坏死、血管出血、炎细胞浸润。乌司他丁组的胰腺及回肠组织损伤较ANP组减轻。假手术组、ANP组、乌司他丁组术后6 h的血TNF-α水平分别为(10.83±0.96)、(181.89±4.93)、(128.23±2.40)ng/L；DAO活性分别为(354.79±3.67)、(117.21±5.58)、(282.98±9.12) U/L；回肠组织ZO-1蛋白表达量分别为(10.00±1.87)、(1.20±0.84)、(5.80±2.86)分；ZO-1 mRNA表达量为0.878±0.015、0.466±0.023、0.778±0.033。ANP组血TNF-α水平较假手术组明显升高， DAO活性、回肠组织ZO-1 mRNA及蛋白表达较对照组明显降低(P值均<0.05)；乌司他丁组的血TNF-α水平较ANP组降低，DAO活性、回肠组织ZO-1 mRNA及蛋白表达较ANP组明显升高(P值均<0.05)。结论乌司他丁可能通过抑制TNF-α的过度释放、提高血浆中DAO活性，从而上调回肠组织中ZO-1 mRNA和蛋白表达，进而保护肠黏膜屏障。

胰腺炎，急性坏死性； 乌司他丁； 大鼠； 紧密连接蛋白-1； 肠黏膜屏障

重症急性胰腺炎(SAP)急性期发作时全身炎症细胞被过度激活并大量释放细胞因子[1]。细胞因子及内毒素的产生可造成机体毛细血管渗漏，肠黏膜组织水肿、缺血坏死，紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)被破坏，从而引起肠屏障功能障碍，导致肠道细菌易位、内毒素进入循环，诱发和加重全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能障碍综合征(MODS)。因此研究SAP时肠道屏障损伤的可能机制意义重大。本实验应用乌司他丁干预急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠，旨在观察其对肠黏膜屏障的保护作用，探讨可能的机制，为临床治疗提供实验依据。

材料和方法

一、实验动物及分组

清洁级雄性SD大鼠60只，体重200～220 g，购自上海斯莱克实验动物公司。按完全随机法分为假手术组、ANP组和乌司他丁组，各20只。参照杨波等[2]方法，采用5%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g体重)逆行注入胰胆管制备ANP模型。乌司他丁组于造模后5 min，在左后肢股静脉置管，连接微量注射泵以1000 IU/100 g体重剂量注入乌司他丁，约10 min内注射完毕。假手术组大鼠开腹后仅翻动胰腺即关腹。假手术组和ANP组大鼠于术后5 min由左后肢股静脉注入等容积生理盐水。造模后6、24 h经门静脉置管采血3～4 ml，切取胰腺组织2 cm×1 cm×0.2 cm及距回盲部5 cm处的回肠组织2 cm×0.5 cm×0.2 cm。

二、血清TNF-α及血浆二胺氧化酶(DAO)检测

取血后，部分分离血清，部分血注入盛有2%消炎痛-EDTA液的试管。摇匀后均经4℃ 3000 r/min离心15 min，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法分别检测TNF-α及DAO含量，按试剂盒(美国RD公司)说明书操作。

三、胰腺组织、回肠组织病理学检查

取胰腺及部分回肠组织常规固定、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察病理改变。

四、回肠组织ZO-1蛋白检测

应用免疫组化方法，按PV-6001通用型二步法检测试剂盒(北京中杉金桥公司)说明书操作。兔抗大鼠ZO-1一抗(北京博奥森公司)工作浓度1∶100，最后DAB显色5 min。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，已知阳性回肠组织为阳性对照。胞质及少量胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为染色阳性。每张切片高倍镜下随机选取5个视野观察，并参照文献[2]结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞占1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，81%～100%为4分；染色阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分。两分值乘积为该例组织的免疫组化评分(IHCS)。观察5张切片，取均数。

五、回肠组织ZO-1 mRNA检测

采用RT-PCR半定量分析。取冻存的回肠组织，用Trizol提取组织总RNA。按照逆转录试剂盒(TOYOBO公司)逆转录cDNA后，进行PCR扩增。引物序列：ZO-1上游5′-CTCGGGCATTATTCGCCTTC-3′，下游5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，片段长度205 bp；内参β-actin上游5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游 5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，片段长度457 bp。PCR反应条件：94 ℃5 min； 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪检测，以ZO-1 mRNA与β-actin mRNA扩增片段灰度比值表示ZO-1 mRNA表达量。

六、统计学方法

结 果

一、动物存活情况

假手术组大鼠无死亡；ANP组大鼠6 h内死亡1只，24 h内死亡2只，死亡率为15%(3/20)；乌司他丁组大鼠24 h内死亡1只，死亡率为5%(1/20)。

二、血TNF-α、DAO活性变化

ANP组血清TNF-α水平明显高于假手术组(P<0.05)；而血浆DAO活性明显低于假手术组(P<0.05)。乌司他丁组血清TNF-α水平较ANP组明显降低，但仍显著高于假手术组(P值均<0.05)；血浆DAO活性较ANP组明显升高，但仍明显低于假手术组(P值均<0.05，表1)。

组 别只数TNF⁃α水平(ng/L)6h24hDAO活性(U/L)6h24h假手术组2010．83±0．969．89±0．14354．79±3．67313．36±4．43ANP组 20181．89±4．93a198．89±4．83a117．21±5．58a91．18±1．09a乌司他丁组20128．23±2．40ab106．79±3．30ab282．98±9．12ab234．11±8．89ab

注：与假手术组比较，q值为4.25、4.41、4.36、4.27、3.86、3.74、3.34、3.38，aP<0.05；与ANP组比较，q值为3.27、3.36、3.21、3.65，bP<0.05

三、胰腺和回肠组织病理学改变

假手术组胰腺及回肠组织无明显异常。ANP组大鼠腹腔内见大量血性腹水，大网膜、肠系膜上可见皂化斑，胰腺肿大，镜下见胰腺大片坏死，大量炎性细胞浸润；回肠黏膜绒毛上皮坏死脱落，血管充血扩张，大量中性粒细胞浸润。乌司他丁组大鼠腹腔内血性腹水、大网膜及肠系膜上皂化斑明显减少，胰腺轻度肿大，镜下见胰腺坏死灶、血管破裂出血明显减轻，少量炎细胞浸润；回肠组织坏死、血管破裂出血、炎细胞浸润不明显(图1)。

图1假手术组(a)、ANP组(b)和乌司他丁组(c) 6 h时大鼠胰腺(上)及回肠(下)组织病理学改变(HE ×200)

四、回肠组织ZO-1 mRNA和蛋白表达的变化

假手术组ZO-1蛋白均匀一致地分布于小肠上皮细胞连接处的尖端，呈蜂巢状；ANP组ZO-1蛋白分布不均，染色变浅，IHCS明显低于假手术组(P<0.05)；乌司他丁组ZO-1蛋白分布趋向较ANP组均匀，IHCS明显高于ANP组，但仍明显低于假手术组(P值均<0.05，图2，表2)。

图2假手术组(a)、ANP组(b)和乌司他丁组(c)6 h时大鼠回肠组织ZO-1蛋白表达(免疫组化 ×200)

ANP组ZO-1 mRNA表达较假手术组明显减少(P<0.05)；乌司他丁组ZO-1 mRNA表达较ANP组明显增强，但仍显著低于假手术组(P值均<0.05，图3，表2)。

M:Marker；1～2：假手术组；3～4：ANP组；5～6：乌司他丁组

组 别只数ZO⁃1蛋白表达(IHCS)6h24hZO⁃1mRNA表达6h24h假手术组2010．00±1．878．60±2．190．878±0．0150．830±0．024ANP组201．20±0．84a0．80±0．84a0．466±0．023a0．550±0．027a乌司他丁组205．80±2．86ab2．40±1．14ab0．778±0．033ab0．704±0．011ab

注： 与假手术组比较，q值为4.40、4.36、4.36、4.05、3.82、4.21、4.27、3.51，aP<0.05；与ANP组比较，q值为3.86、3.24、4.27、3.51，bP<0.05

讨 论

传统治疗SAP的重点围绕着“抑制胰腺分泌，抑制胰蛋白酶活性和补充抗蛋白酶等方面”展开。近年来，随着对SAP时MODS、细菌易位、肠源性感染等的深入研究，肠道屏障功能逐渐被人们所重视。肠黏膜屏障一般由机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障4部分组成[3]。其中与肠黏膜通透性关系最为密切的是机械屏障。它由肠黏膜表面的黏液层、肠上皮细胞本身及其紧密连接、上皮基底膜、黏膜下固有层等组成。紧密连接对维持肠黏膜上皮屏障功能的完整性有重要作用，能有效地阻止肠腔内细菌、毒素、炎性介质等易位[4]。紧密连接由多种蛋白组成[5]，包括ZOs、occludin、Claudin等结构蛋白[6-7]和肌动蛋白、肌球蛋白、E钙粘素等调节蛋白。ZO-1常被用来作为观察各种组织紧密连接屏障功能和通透性功能的指标，有研究[8-9]发现，TNF-α可激活上皮细胞间的肌球蛋白轻链激酶，调整紧密连接蛋白Occludin和ZO-1在紧密连接膜微区的分布，造成紧密连接处功能障碍，引起黏膜通透性增加。

DAO是特异性存在于人类和所有哺乳动物肠黏膜上皮细胞胞质中具有高度活性的细胞内酶，其在小肠黏膜上皮层绒毛中含量高、活性强。正常情况下血浆中检测不到DAO。当肠黏膜上皮细胞受损、坏死后，DAO释放进入细胞间隙、淋巴管和血循环，或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔，导致血浆和肠腔DAO活性增高。外周血中DAO活性稳定，是反映肠道黏膜上皮细胞完整性的血浆标志物[10]。

本实验显示，ANP大鼠的血TNF-α含量较假手术组明显升高，DAO活性较假手术组明显下降，肠黏膜坏死，肠黏膜组织ZO-1 mRNA和蛋白表达明显下降，表明制模后TNF-α等细胞因子大量释放及微循环灌注不足，导致肠黏膜上皮细胞坏死，ZO-1 mRNA和蛋白表达减少，肠黏膜屏障被破坏。

乌司他丁是从人尿中分离纯化出的一种糖蛋白[11]，分子量约为67000，经国内外学者研究证实其具有抑制蛋白水解酶、糖类和脂类水解酶的活性；稳定溶酶体膜，抑制溶酶体的释放；抑制炎症介质和细胞因子的释放等作用。本实验结果显示，乌司他丁干预ANP大鼠后，血TNF-α含量降低，DAO活性升高，肠黏膜坏死减轻，肠黏膜组织ZO-1 mRNA和蛋白表达增加，表明乌司他丁对ANP时的肠道屏障损伤起到保护作用。

[1] Ammori BJ. Gut barrier dysfunction in patients with acute pancreatitis. J Hepatobiliary Pancreat Surg,2002,9:411-412.

[2] 杨波，黄鹤光，陈大良，等.逆行性胰胆管注射法制作重症急性胰腺炎大鼠模型.福建医科大学学报,2002,1:71-72.

[3] Soslow RA, Dannenberg AJ, Rush D, et al. COX-2 is expressed in human pulmonary, colonic, and mammary tumors. Cancer,2000,89:2637-2645.

[4] Baumgart DC, Dignass AU. Intestinal barrier function. Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2002,5:685-694.

[4] Nusrat A, Parkos CA, Verkade P, et al. Tight junctions are membrane microdomains. J Cell Sci,2000,113:1771-1781.

[5] Köhler K,Zahraoui A.Tight junction: a co-ordinator of cell signalling and membrane trafficking.Biol Cell,2005,97:659-665.

[6] Furuse M,Fujita K,Hiiragi T,et al.Claudin-1 and -2:novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin.J Cell Biol,1998,141:1539-1550.

[7] Matsuda M, Kubo A, Furuse M, et al. A peculiar internalization of claudins, tight junction-specific adhesion molecules, during the intercellular movement of epithelial cells. J Cell Sci,2004,117:1247-1257.

[8] Youakim A, Ahdieh M. Interferon-gamma decreases barrier function in T84 cells by reducing ZO-1 levels and disrupting apical actin. Am J Physiol,1999,276:G1279-G1288.

[9] Blikslager AT, Moeser AJ, Gookin JL, et al. Restoration of barrier function in injured intestinal mucosa. Physiol Rev,2007,87:545-564.

[10] 黎君友, 付小兵, 胡森,等.二胺氧化酶在创伤后肠道损伤中变化及意义.中国危重病急救医学,2000,12:482-484.

[11] Suzuki M, Kobayashi H, Tanaka Y, et al. Structure and function analysis of urinary trypsin inhibitor (UTI): identification of binding domains and signaling property of UTI by analysis of truncated proteins. Biochim Biophys Acta,2001,1547:26-36.

Protectivemechanismofulinastatinonmucosalbarrierinratswithacutenecrotizingpancreatitis

CAOHong-qing,HUANGHe-guang,CHENYan-chang,LIHong-sen.
DepartmentofGeneralSurgery,UnionHospital,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China

HUANGHe-guang,Email:hhuang2@yahoo.com.cn

ObjectiveTo study the changes of serum levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α), diamine oxidase (DAO), the expression of tight junction protein-1 (zonula occludens 1, ZO 1) in acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats after ulinastatin intervention.MethodsSD male rats were randomly divided into sham operation (SO) group, ANP group and ulinastatin treatment group. ANP model was induced by injecting 5% sodium taurocholate into biliary and pancreatic duct. The rats were sacrificed at 6 and 24 hours, and then the levels of TNF-α, DAO and pathology change in pancreatic and intestinal were determined. The expression of bowel mucosa ZO-1 mRNA and protein was detected by RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsSix hours after ANP induction, massive pancreatic necrosis and inflammatory cells infiltration were present, while epithelium necrosis of villi in ileum, vessel hemorrhage and inflammatory cells infiltration was found. The pathologic injury of pancreas and ileum in ulinastatin group was reduced when compared with that in ANP group. The serum levels of TNF-α were (10.83±0.96), (181.89±4.93), (128.23±2.40)ng/L in SO group, ANP group and ulinastatin group; and the activities of DAO were (354.79±3.67),(117.21±5.58),(282.98±9.12)U/L; the expressions of ZO 1 protein were 10.00±1.87, 1.20±0.84, 5.80±2.86; and the expressions of ZO 1 mRNA were 0.878±0.015,0.466±0.023, 0.778±0.033. The serum level of TNF-α in ANP group was significantly higher than that in SO group, while the activities of DAO, expressions of ZO 1 mRNA and protein in ileum were significantly lower than that in SO group (P<0.05). The serum level of TNF-α in ulinastatin group was significantly lower than that in ANP group, while the activities of DAO, expressions of ZO 1 mRNA and protein in ileum were significantly higher than that in ANP group (P<0.05).ConclusionsUlinastatin may inhibit the over release of TNF-α and improve plasma DAO activity, then increase the expression of ZO-1 mRNA and protein, thus protect the intestinal mucosa barrier.

Pancreatitis, acute necroting； Ulinastatin； Rat； Zonula occludens-1； Intestinal mucosal barrier

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.014

福建省自然科学基金(2008J0086)；黎介寿院士肠道屏障研究专项基金；天普研究基金(01200915)

350001 福州，福建医科大学附属协和医院普外科

黄鹤光，Email:hhuang2@yahoo.com.cn

2011-04-27)

(本文编辑：屠振兴)