氧调节蛋白150在急性坏死性胰腺炎胰腺损伤中的作用

刘垒 邓文宏 陈辰 李金友 王卫星

·短篇论著·

氧调节蛋白150在急性坏死性胰腺炎胰腺损伤中的作用

刘垒 邓文宏 陈辰 李金友 王卫星

重症急性胰腺炎(severe acute pancreastitis, SAP)是临床常见的急腹症，病情凶险，病死率高，易伴发全身炎症反应综合征(SIRS)，甚至多器官功能不全综合征(MODS)。氧调节蛋白150(ORP150)是葡萄糖调节蛋白(GRPs)家族的成员。它作为一种应激蛋白，正常情况下表达很低。当细胞和组织暴露于缺氧、缺血-再灌注损伤等应激环境时则能诱发内质网应激，从而使ORP150的表达增高。本研究观察急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺组织中ORP150基因的表达，探讨其在ANP大鼠胰腺损伤中的作用。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：6～7周龄SPF级雄性Wistar大鼠54只，购自湖北省疾病控制中心，体重200～240 g。按完全随机法将大鼠分为假手术1、3、6、12 h组，ANP 1、3、6、12 h组和塞来昔布治疗1 h组，每个时间点6只大鼠。假手术组大鼠在开腹后仅翻动十二指肠和胰腺即关腹。ANP组经胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠1 ml/kg体重(Sigma公司)制模。治疗组于造模前30 min经股静脉注射塞来昔布10 mg/kg体重。所有大鼠术后均皮下注射生理盐水20 ml/kg体重补液。按各时间点处死大鼠，心脏采血，离心分离血清，保存于-20℃备用，取胰头组织4%多聚甲醛固定，其余胰腺组织经液氮固定后冻存于-80℃。

2．血清淀粉酶检测：血清淀粉酶采用全自动生化分析仪测定。

3．胰腺组织病理学检查：取多聚甲醛固定的胰头组织，常规脱水、包埋、切片、HE染色。由2位病理科医师采用双盲法于光镜下观察胰腺组织的病理学改变，并参照Schmidt等[1]标准进行评分。

4．胰腺组织ORP150 mRNA表达检测： ORP150 (495 bp)引物序列：上游5′-TCTCCTACCACCTCTATTT-3′，下游5′-CAGCACCCTTCCTACA-3′；Actin(207 bp)引物序列：上游5′-CCAACTGGGACGATATGGAG-3′，下游5′-CAGAGGCATACA-GGGACAAC-3′，引物由Invitrogen公司合成。采用RT-PCR检测ORP150 mRNA表达。取约100 mg胰腺组织，应用Trizol(Invitrogen公司)抽提组织总RNA。应用cDNA逆转录试剂盒(TOYOBA公司)逆转录成cDNA。应用PCR试剂盒(MBI Fermentas公司)行PCR反应。反应条件： 94℃ 5 min，94℃ 30 s、54℃(ORP150)或56℃(Actin)30 s、72℃ 1 min，35个循环，72℃ 7 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、扫描，以ORP150与Actin条带的灰度比值表示ORP150 mRNA的表达水平。

5．胰腺组织ORP150蛋白表达的检测：取-80℃保存的胰腺组织50 mg，用冰预冷的0.01 mol/L PBS充分洗涤后，加入适量RIPA蛋白提取液裂解40 min， 4℃离心取上清，常规行蛋白质印迹法检测ORP150蛋白的表达。兔抗大鼠ORP150一抗(Santa Cruz公司)工作浓度1∶3000，HRP-山羊抗兔IgG(Pierce公司)工作浓度1∶1000。最后ECL(Santa Cruz公司)发光，X线底片曝光、显影。以ORP150条带与内参条带的灰度比值表示ORP150蛋白表达水平。

二、结果

1．血清淀粉酶变化：假手术1、3、6、12 h组，ANP 1、3、6、12 h组和塞来昔布治疗1 h组大鼠的血清淀粉酶活性分别为(930±117)、(945±110)、(1047±176)、(1061±148)、(2649±374)、(3562±286)、(4166±402)、(5549±637)、(1523±65)U/L，ANP组较假手术组明显升高，且随时间延长而逐渐升高，治疗组较ANP 1 h组显著降低，但仍显著高于假手术组，差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。

2．胰腺组织病理变化：假手术组大鼠的胰腺组织未见明显病理改变；ANP组大鼠胰腺可见不同程度的水肿、出血及片状坏死，腺叶间隙增宽，炎性细胞浸润等，且随病程延长逐渐加重；治疗1 h组大鼠胰腺的损伤较ANP 1 h组有所减轻(图1)。假手术1、3、6、12 h组，ANP 1、3、6、12 h组和塞来昔布治疗1 h组大鼠的胰腺病理评分分别为(0.18±0.02)、(0.22±0.02)、(0.26±0.41)、(0.35±0.27)、(5.15±0.56)、(7.69±0.63)、(9.81±0.57)、(11.30±1.70)、(3.23±0.31)分，ANP组较假手术组明显升高，且随时间延长而逐渐升高，治疗组较ANP 1 h组显著降低，但仍显著高于假手术组，差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。

3．胰腺组织ORP150 mRNA及蛋白表达的变化：假手术1 h组，ANP 1、3、6、12 h组和塞来昔布治疗1 h组大鼠胰腺组织ORP150 mRNA表达量分别为0.058、0.589、0.097、0.093、0.044和1.338；ORP150蛋白表达量分别为0.040、1.645、1.605、0.490、0.174和2.250(图2、3)。ANP 1 h组的ORP150 mRNA及蛋白表达最高，随着时间延长表达逐渐降低，除12 h点mRNA表达量外，其他各组均显著高于假手术组，塞来昔布治疗1 h组的表达量又较ANP 1 h组显著升高，各组间差异具有统计学意义(P值均<0.05)。

图1假手术 1 h组(a)，ANP 1、3、6、12 h组(b～e)和塞来昔布治疗1h组(f)大鼠的胰腺病理变化(HE ×200)

图2 各组胰腺组织ORP150 mRNA的表达

图3 各组胰腺组织ORP150蛋白表达

讨论氧化应激是机体内活性氧(ROS)和活性氮(RNS)大量生成及抗氧化物质失衡状态下，直接或间接通过信号转导通路引起的细胞损伤[2]。很多危重疾病，如脓毒血症、烧伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、艾滋病(AIDS)等都会出现ROS、RNS的增加和抗氧化能力下降[3]。氧化应激在急性胰腺炎(AP)胰腺损伤、局部或全身并发症中亦起着至关重要的作用[4-7]。氧自由基直接参与了AP相关的MODS中的细胞损伤和细胞内信号途径的调节，同时亦参与了AP时白细胞的激活、NF-κB活化引起的炎性细胞因子的表达、微循环障碍等过程[8]。

ORP150是一类存在于内质网的蛋白质，广泛分布于肝脏、脑、胰腺、肺等组织[9]。它与其他葡萄糖调节蛋白一起应对各种应激环境。当机体处于应激环境时，ORP150高表达，与受损或者新合成的蛋白质短暂性地结合，防止其形成二聚体和蛋白质构象的错误折叠[10-13]。ORP150作为内质网的分子伴侣，在很多疾病的发病过程中均发挥着保护作用。有研究报道，ORP150能抑制缺氧导致的细胞凋亡，对缺氧情况下的脑组织和心肌细胞的凋亡有保护作用。抑制ORP150在脑星形细胞的表达会加快细胞的缺氧死亡，而刺激体外培养的神经元ORP150表达则能阻止脑细胞的缺氧性死亡。此外，ORP150的表达能加快皮肤伤口愈合，改善大鼠缺血性骨坏死[14-18]。

本研究结果显示，ANP大鼠胰腺组织ORP150基因表达在制模后1 h即迅速升高，然后逐渐下降，推测ORP150可能通过内质网应激参与了ANP的发病过程。但ORP150在ANP大鼠胰腺损伤中发挥作用的具体机制目前尚不清楚，有待于进一步研究。

国外有体外实验证实塞来昔布能够上调组织中的ORP150表达水平[19]。因此，本研究选用塞来昔布作为干预手段来观察ANP大鼠胰腺组织ORP150表达水平的变化。结果显示，在制模前1 h给予塞来昔布干预，胰腺组织中的ORP150 mRNA和蛋白的表达水平较ANP 1 h组确实升高，胰腺组织病理损伤减轻，胰腺病理学评分及血清淀粉酶水平均降低，提示ORP150表达水平的提高在ANP的胰腺损伤中发挥了保护作用。

[1] Schmidt J, Lewandrowsi K, Warshaw AL, et al. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. Int J Pancreatol, 1992, 12: 41-51.

[2] Dryden GW Jr, Deaciuc I, Arteel G, et al. Clinical implications of oxidative stress and antioxidant therapy. Curr Gastroenterol Rep, 2005, 7:308-316.

[3] Roth E, Manhart N, Wessner B. Assessing the antioxidative status in critically ill patients. Curr Opin Nutr Metab Care, 2004, 7:161-168.

[4] Thareja S, Bhardwaj P, Sateesh J, et al.Variations in the levels of oxidative stress and antioxidants during early acute pancreatitis. Trop Gastroenterol, 2009, 30: 26-31.

[5] 王艳红,冯志杰,郝晓.急性胰腺炎与氧化应激.世界华人消化杂志,2007,15: 1266-1272.

[6] Leung PS, Chan YC. Role of oxidative stress in pancreatic inflammation. Antioxid Redox Signal, 2009,11:135-165.

[7] 杨成林, 张树友. 氧化应激与急性胰腺炎治疗相关的研究进展. 医学综述, 2004, 13:519-521.

[8] Esrefoglu M, Gül M, Ates B, et al. Antioxidative effect of melatonin, ascorbic acid and N-acetylcysteine on caerulein-induced pancreatitis and associated liver injury rats. World J Gastroenterol, 2006, 12:259-264.

[9] Kobayashi T, Ohta Y. Enforced expression of oxygen-regulated protein, ORP150, induces vacuolar degeneration in mouse myocardium. Transgenic Res, 2003, 12:13-22.

[10] Kuznetsov G, Chen LB, Nigam SK. Several endoplasmic reticulum stress proteins, including ERp72, interact with thyroglobulin during its maturation. J Biol Chem, 1994, 269:22990-22995.

[11] Toledo H, Carlino A, Vidal V, et al. Dissociation of glucose-regulated protein Grp78 and Grp78-IgE Fc complexes by ATP. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 2505-2508.

[12] Ni M, Lee AS. ER chaperones in mammalian development and human diseases. FEBS Lett, 2007,581:3641-3651.

[13] Ron D, Walter P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007,8:519-529.

[14] Ozawa K, Kuwabara K, Tamatani M, et al.150-kDa oxygen-regulated protein (ORP150)suppresses hypoxia-induced apoptotic cell death. J Biol Chem, 1999, 274:6397-6404.

[15] Tamatani M, Matsuyama T, Yamaguchi A, et al. ORP150 protects against hypoxia/ischemia-induced neuronal death. Nat Med, 2001,7:317-323.

[16] Aleshin AN, Sawa Y, Kitagawa-Sakakida S, et al.150-kDa oxygen-regulated protein attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury in rat heart. J Mol Cell Cardiol, 2005, 38:517-525.

[17] Ishida Y, Kimura A, Takayasu T, et al. Expression of oxygen-regulated protein 150 (ORP150) in skin wound healing and its application for wound age determination. Int J Legal Med, 2008, 122:409-414.

[18] Sato M, Sugano N, Ohzono K, et al. Apoptosis and expression of stress protein(ORP150, HO1) during development of ischaemic osteonecrosis in the rat. J Bone Joint Surg Br, 2001, 83:751-759.

[19] Namba T, Hoshino T, Tanaka K. Up-regulation of 150-kDa oxygen-regulated protein by celecoxib in human gastric carcinoma cells. Mol Pharmacol, 2007, 71:860-870.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.017

武汉大学2008年博士研究生(含1+4)自主科研项目(20083020101000061);国家自然科学基金面上项目(81070368);中央高校基本科研业务费专项资金(4104003)

430060 湖北，武汉大学人民医院普通外科

王卫星，Email：sate.llite@163.com

2010-06-17)

(本文编辑：吕芳萍)