T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1在胰腺癌中的表达及其意义

郭兴军 田锐 王敏 何政 李旭 谢晨成 赵睿 秦仁义

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1在胰腺癌中的表达及其意义

郭兴军 田锐 王敏 何政 李旭 谢晨成 赵睿 秦仁义

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor,Tiam1)被证实在多种肿瘤细胞系中表达，且在肿瘤的发生发展中起到重要作用[1-4]，但Tiam1与胰腺癌的关系尚不明确。本研究检测Tiam1在胰腺癌组织及胰腺癌细胞株中的表达，探讨其临床意义。

一、材料和方法

1．材料：收集我院2009年1月至2010年12月手术切除的胰腺癌组织标本27例，术后病理诊断为胰腺导管腺癌。人胰腺癌细胞系PANC1、MIAPaCa2、BxPC3、ASPC1、PC3为本实验室长期冷冻保存，复苏后常规培养、传代。

RPMI 1640培养基购自HyCone公司；新生牛血清购自HyClone公司；Trizol试剂购自invitrogen公司；Reverse Transcription System试剂盒、Tiam1和GAPDH浓缩型兔抗人Tiam1多抗购自abcam公司。SABC、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司。蛋白质印迹法相关试剂购自武汉博士德公司。ECL显色试剂盒、全细胞蛋白提取试剂盒、BCA法测蛋白浓度试剂盒均购自碧云天公司。

2．Tiam1 mRNA表达检测：应用Trizol提取胰腺癌细胞总RNA。应用逆转录试剂盒(TOYOBO公司)行逆转录反应。应用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)行实时PCR扩增。应用Primer 5.0软件设计引物,Tiam1的上游5′-AGACGTACTCAGGCCATGTC-3′，下游5′-ACC-CAAATGTCGCAGTCAGG-3′，产物252 bp；内参GAPDH上游5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下游5′-GACAAGCTTCCC-GTTCTCAG-3′，产物259 bp。引物由Invitrogen公司合成。PCR反应条件：95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，40个循环。mRNA表达量用2-ΔΔCt公式计算。ΔΔCt =[Ct(Tiam1)-Ct(GAPDH)]实验组-[Ct(Tiam1)-Ct(GAPDH)]对照组。 以MIAPaCa2的表达量作为对照，计为1。重复3次实验,取均值。

3．Tiam1蛋白检测：用细胞裂解液提取全细胞蛋白，BCA法测蛋白浓度。常规行蛋白质印迹法检测Tiam1蛋白表达。Tiam1抗体工作浓度为1∶100。用Quality one软件对条带进行定量吸光值分析，以MIAPaCa2的表达量作为对照，计为1。

胰腺癌和癌旁正常胰腺组织采用免疫组化染色法检测Tiam1蛋白表达。Tiam1抗体工作浓度为1∶500,以PBS取代一抗为阴性对照。胞质和胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。高倍镜下观察5个视野。判断标准[5]：无染色为阴性，浅黄色细胞≤10%为可疑阳性(±)，浅黄色细胞>10%为弱阳性(+)，棕黄色细胞>30%为阳性(++)，棕黄色细胞>70%为强阳性(+++)。±、+为低表达，++、+++为高表达。

4．统计学处理：采用SPSS17.0软件包进行处理。免疫组化结果采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

二、结果

MIA-PaCa2、PANC1、BxPC3、ASPC1、PC3细胞的Tiam1 mRNA表达水平分别为1、0.9883、0.6391、0.5340、0.4067； Tiam1蛋白表达水平分别为1、0.9711、0.5743、0.3720、0.2902(图1)。

27例胰腺癌标本中均有Tiam1蛋白表达，而癌旁正常胰腺组织中不表达Tiam1蛋白(图2)。胰腺癌组织Tiam1蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小均无关，而与胰腺癌的病理分化程度和转移明显相关(表1)。

图1 胰腺癌细胞Tiam1蛋白的表达

图2胰腺癌旁组织(a)、胰腺癌组织Tiam1蛋白低(b)和高(c)表达(×100)

表1 胰腺癌组织Tiam1蛋白表达与临床病理特征间的关系

讨论Tiam1基因位于人染色体21q22·1，其编码产物是由1591个氨基酸残基组成的蛋白质，属于Dbl家族成员(diffuse B-cell lymphoma oncogene family)[6]。Tiam1含有许多重要的功能区：羧基端DH和PHc功能区，氨基端PHn-CC-EX结构区和DHR(或称PDZ)、RBD功能区等。

Borguignon等[7]报道，Tiam1可以通过影响下游的rac1调节细胞的增殖、侵袭转移。王雅娟等[8]报道，Tiam1在结肠癌、乳腺癌的发生发展中起到重要作用。Engers等[4]、Ding等[9]报道，Tiam1表达与肝癌、前列腺癌患者的预后密切相关， Tiam1高表达患者的预后明显较差。本研究结果显示，胰腺癌细胞系的Tiam1蛋白和mRNA表达在侵袭能力较弱、分化程度较高的BxPC3、ASPC1、PC3细胞系中相对低表达；在侵袭能力较强、分化程度较低的MIAPaCa2、PANC1细胞系中相对高表达。胰腺癌组织100%表达Tiam1蛋白，而癌旁胰腺组织不表达Tiam1蛋白。提示Tiam1基因高表达参与胰腺癌的发生发展，其高表达反映了肿瘤的恶性生物学行为。

[1] Michel MM, Sarr MG, Oishi AJ, et al. Pancreatic cancer. CA Cancer J Clin, 1994,44: 304-318.

[2] Adams HC 3rd, Chen R,Liu Z,et al. Regulation of breast cancer cell motility by T-cell lymphoma invasion and metastasis inducing protein. Breast Cancer Res,2010,12: R69.

[3] 刘莉,许岸高,王蔚,等.大肠肿瘤中Tiam1的表达及临床意义.临床与实验病理学杂志,2006,1001-7399(2006) 02-0137-04.

[4] Engers R, Mueller M, Walter A, et al. Prognostic relevance of Tiam1 protein expression in prostate carcinomas. Br J Cancer, 2006,95:1081-1086.

[5] Uozaki H, Horiuchi H, Ishida T, et al. Overexpression of resistance-related proteins in osteosarcoma. Relationship with poor pregnosis Cancer,1997, 79: 2336-2344.

[6] Rossman KL, Der CJ, Sondek J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6: 167-180.

[7] Bourguignon LY, Zhu H, Shao L, et al. CD44 Interaction with Tiam1 promotes rac1 signaling and hyaluronic acid-mediated breast tumor cell migration. J Biol Chem,2000, 275:1829-1838.

[8] 王雅娟,胡洁,韩慧霞，等.Tiam1与大肠癌细胞EMT的关系.世界华人消化杂志,2009,17：3337-3341.

[9] Ding Y, Chen B,Wang S, et al. Overexpression of Tiam1 in hepatocellular carcinomas predicts poor prognosis of HCC patients. Int J Cancer,2009,124:653-658.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.015

国家自然科学基金(81001068)、(81071775)

430030 湖北武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科中心

秦仁义，Email:ryqin@tjh.tjmu.edu.cn

2011-06-22)

(本文编辑：吕芳萍)