急性坏死性胰腺炎大鼠甲状腺滤泡旁细胞功能和超微结构的变化

杨波 刘黎明 邓文宏 陈辰 余佳 金浩 王卫星

·论著·

急性坏死性胰腺炎大鼠甲状腺滤泡旁细胞功能和超微结构的变化

杨波 刘黎明 邓文宏 陈辰 余佳 金浩 王卫星

目的观察急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠甲状腺滤泡旁细胞超微结构和功能的变化，探讨ANP并发低钙血症的可能机制。方法雄性Wistar大鼠32只，按数字表法随机分为假手术组(SO组)及ANP 3、6、12 h组。采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液制备ANP模型。检测血淀粉酶、脂肪酶、降钙素及Ca2+水平。取胰腺组织常规病理检查，取甲状腺腺叶组织电镜下观察滤泡旁细胞超微结构改变。结果ANP组6 h的血淀粉酶、 脂肪酶、降钙素水平分别为(4025±579)U/L、(8272±794)U/L、(383.6±64.5)pg/ml，均显著高于SO组的(1063±129)U/L、(55±18)U/L、(143.1±42.2)pg/ml；血清Ca2+水平为(2.41±0.12 )mmol/L ，显著低于SO组的(2.97±0.12)mmol/L(P值<0.05或<0.01)。ANP组12 h的血清降钙素水平为(317.1±78.2)pg/ml，较6 h时显著降低(P<0.01)。ANP组大鼠甲状腺滤泡旁细胞核膜内陷，线粒体、游离核糖体增生，粗面内质网、高尔基体融合，分泌颗粒增多；6 h后细胞器开始减少并消失，仅余少量分泌颗粒。结论ANP大鼠的甲状腺滤泡旁细胞结构和功能发生改变，从而导致低钙血症的发生。

胰腺炎，急性坏死性； 甲状腺滤泡旁细胞； 透射电子显微镜检查

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)常并发一个或多个脏器功能障碍，且常伴有严重的代谢功能紊乱，包括低钙血症等[1]。甲状腺滤泡旁细胞能够产生降钙素原，并分泌有激素活性的降钙素，从而调节血清Ca2+水平[2]。目前对SAP患者血钙降低的机制尚不明确。本研究建立急性坏死性胰腺炎(ANP)模型，观察甲状腺滤泡旁细胞形态学及功能的变化，探讨其与低钙血症之间的相关性。

材料与方法

一、动物分组及模型制备

SPF级雄性Wistar大鼠32只由湖北省疾病预防控制中心提供，体重200～250 g，按数字表法随机分为假手术组(SO组)及ANP 3、6、12 h组，每组8只。参照Aho等[3]的方法，于胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)溶液1 ml/kg体重，制备ANP模型。SO组开腹仅翻动十二指肠及胰腺后逐层关腹。造模后3、6、12 h心脏穿刺取血，离心分离血清；取胰腺组织，甲醛固定；取双侧甲状腺组织，以2.5%戊二醛固定。SO组于0、3、6、12 h各抽2只取标本，结果以总的均值表示。

二、血淀粉酶、脂肪酶、降钙素和Ca2+水平检测

血淀粉酶、脂肪酶和Ca2+水平由武汉大学人民医院检验科全自动生化分析仪测定。血清降钙素水平由武汉大学人民医院核医学科采用放射免疫法测定，试剂盒购自北京科美生物技术有限公司。

三、胰腺病理检查

取固定的胰腺组织，常规包埋、切片、HE染色。由病理科医师盲法读片，按Schmidt等[4]标准评分。

四、甲状腺组织电镜检查

戊二醛固定的甲状腺组织再经1%锇酸固定、梯度乙醇-丙酮脱水、包埋、超薄切片、醋酸双氧铀-枸橼酸铅染色，最后在日立H-300型透射电镜下观察并摄片。

五、统计学处理

结 果

一、大鼠血淀粉酶、脂肪酶、降钙素、Ca2+及胰腺组织病理变化

ANP组大鼠血淀粉酶、脂肪酶、降钙素水平均较SO组显著升高，但ANP组12 h的血降钙素水平较6 h时降低。ANP组大鼠血Ca2+水平较SO组显著下降(表1)。SO组胰腺组织未见病理改变；ANP组胰腺组织可见腺泡破坏，组织水肿、坏死，间质充血、炎性细胞浸润，且随时间延长呈进行性加重，病理评分逐渐升高(表1)。

表1 各组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平及胰腺病理评分变化

注：与SO组比较,a：t值3.049～23.844，P值均<0.01；与ANP组3 h组比较,b:t值2.324～8.158，P值<0.05或<0.01；与ANP 6 h组比较，c:t值2.506～3.832，P值均<0.01

二、甲状腺滤泡旁细胞超微结构改变

SO组大鼠甲状腺滤泡旁细胞胞核呈圆形或类圆形，胞质内含电子密度较低的分泌颗粒，线粒体较少、呈梭形，高尔基复合体及粗面内质网较发达，并可见大量游离的核糖体。与周围的滤泡上皮细胞之间存在着紧密连接(图1a)。ANP组3 h时大鼠甲状腺滤泡旁细胞核膜内陷，胞质内线粒体、游离核糖体大量增生(图1b)，粗面内质网、高尔基体融合，并产生大量低电子密度颗粒(图1c)，细胞间出现间隙连接，间质毛细血管灌注不足(图1d)；6 h时胞质内细胞器开始减少，胞质内微管、微丝及中性纤维增生，细胞外基质胶原纤维增生(图1e)；12 h时细胞核皱缩，胞质内细胞器消失(图1f)，仅存少量分泌颗粒，与相邻细胞的连接消失。

讨 论

甲状腺滤泡旁细胞起源于神经嵴，能够摄取胺前体并对其进行脱羧产生降钙素原，并分泌具有生物活性的降钙素，与甲状旁腺素一起维持机体的血钙平衡。Kimmel等[5]报道，低钙血症在急性胰腺炎(AP)猫的发病率约为50%～70%，其血钙下降的程度与胰腺炎的预后密切相关。目前，对于AP时低钙血症发生的机制尚未完全清楚，主要存在以下5种理论[6]：(1)皂化理论；(2)低白蛋白血症理论；(3)内环境激素调节理论；(4)游离脂肪酸理论；(5)组织细胞膜通透性改变。

图1SO组(a)及ANP组3(b、c、d)、6(e)、12(f) h大鼠甲状腺滤泡旁细胞的超微结构变化(a、f×8000；b×10000；c、d、e×12000)

本实验结果显示，ANP组大鼠血清降钙素水平高于SO组。电镜观察到甲状腺滤泡的毛细血管灌注不足，旁细胞的胞核皱缩，胞质内细胞器消失，线粒体、游离核糖体大量增生，粗面内质网、高尔基体融合，并产生及分泌大量低电子密度颗粒。

能够引起降钙素分泌增加的原因很多，包括外周血血钙浓度的反馈调节、血清维生素D水平以及胃泌素、胰高血糖素等的分泌调节。Stumpf等[7]证实，甲状腺滤泡旁细胞具有1，25-(OH)3D受体。外周血游离维生素D可直接作用于滤泡旁细胞，增加降钙素的分泌。我们前期的研究[8]发现，SAP患者血清维生素D结合蛋白水平明显下降，游离形式的维生素D水平升高，从而作用于滤泡旁细胞表面1，25-(OH)3D受体，增加降钙素的分泌。另有研究[9-10]发现，在AP初期胃泌素和胰高血糖素分泌量明显增加。我们推测，在SAP时，机体同样可以通过增加胃泌素和胰高血糖素的分泌促进降钙素的分泌。此外，SAP时大量细胞因子释放入血，可以上调钙敏感受体基因(CASR基因)的表达[11]，激活磷脂酶C，使非特异性离子通道开放，Ca2+内流，细胞膜去极化，并开放L型Ca2+通道，激发降钙素的分泌。同时，CASR基因抑制甲状旁腺细胞增生和甲状旁腺素的表达，导致甲状旁腺素分泌减少，可引起机体的低钙血症[12]。

本研究结果显示，6 h后血清降钙素水平有所下降，其可能的原因为：(1)胃泌素、胰高血糖素等只是在AP初期分泌量增加[6]，6 h后对降钙素的促分泌作用减弱。(2)6 h左右甲状腺滤泡的微循环灌注不足，导致旁细胞对外周血细胞因子和激素的敏感性降低，从而降钙素分泌量减少。(3)6 h后细胞开始出现凋亡，胞质内细胞器减少或消失，从而影响旁细胞对激素的合成和分泌功能。

因此，ANP时甲状腺滤泡旁细胞结构和功能发生的变化是导致AP低钙血症的一个重要原因，但胰腺炎时甲状腺滤泡旁细胞与甲状旁腺功能之间的关系有待进一步研究。

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Ultrastructuralandfunctionalchangesofthyroidparafollicularcellinratswithacutenecrotizingpancreatitis

YANGBo,LIULi-ming,DENGWen-hong,CHENChen,YUJia,JINHao,WANGWei-xing.

DepartmentofGeneralSurgery,Peoples′Hospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:WANGWei-xing,Email:sate.llite@163.com

ObjectiveTo investigate the ultrastructure and function changes of the thyroid parafollicular cell in ANP rats and to study the possible mechanism of hypocalcemia during ANP.MethodsThirty-two male Wistar rats were randomly divided into 4 groups: sham operation group (SO group) and ANP 3, 6, 12 h groups. ANP model was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. The serum levels of amylase, lipoidase, calcitonin and Ca2+were measured. The pathological changes in pancreatic tissue were observed. The ultrastructure changes of thyroid parafollicular cell were observed.ResultsThe serum levels of amylase, lipoidase, calcitonin and Ca2+were (4025±579)U/L, (8272±794)U/L, (383.6±64.5)pg/ml, (2.41±0.12)mmol/L at 6h in ANP group, which were significantly higher than those in SO group [(1063±129)U/L, (55±18)U/L, (143.1±42.2)pg/ml, (2.97±0.12)mmol/L (P<0.05)]. Under the electron-microscopy, the nucleus of thyroid parafollicular cells shrinked and mitochondrial proliferation and endoplasmic reticulum fusion appeared. After 6 h, all the organelle reduced and disappeared, and only small amount of secretory granules remained.ConclusionsChanges in the structure and function of the thyroid parafollicular cells occur in rats of ANP, and they induce the development of hypocalcemia.

Pancreatitis, acute necrotizing; Thyroid parafollicular cell; Transmission electron microscopy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.011

430060 湖北武汉，武汉大学人民医院普外科(杨波、邓文宏、陈辰、余佳、金浩、王卫星)；鄂州市中心医院普外科(刘黎明)

王卫星，Email:sate.llite@163.com

2012-03-19)

(本文编辑：吕芳萍)