胰腺癌及相关胰腺疾病组织中K-ras12、13密码子突变的检测及其临床诊断价值

朱艳平 李泉江 高军 顾俊俊 黄浩杰 李兆申

·论著·

胰腺癌及相关胰腺疾病组织中K-ras12、13密码子突变的检测及其临床诊断价值

朱艳平 李泉江 高军 顾俊俊 黄浩杰 李兆申

目的研究K-ras基因第12、13位密码子突变在胰腺导管腺癌及相关胰腺疾病组织中的定量检测及其临床意义。方法收集经手术切除的130例(胰腺导管腺癌105例，胰腺腺鳞癌8例，胰腺黏液腺癌2例，内分泌癌3例，十二指肠及壶腹部恶性肿瘤6例，胰腺良性疾病6例)有明确病理诊断的组织标本及临床资料，应用双荧光探针联合肽核酸钳制实时定量PCR方法检测组织中K-ras基因第12、13密码子的突变量，以突变量>100拷贝为阳性计算突变阳性率。结果胰腺导管腺癌、腺鳞癌、黏液腺癌、内分泌癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤、胰腺良性疾病的K-ras12密码子突变量的中位数及四分位数分别为4062(495，10800)、238(45,8420)、15(9,21)、3(3,16)、2283(73,5037)和21(8,56)；突变阳性率分别为84.8%(89/105)、50.0%(4/8)、0、0、66.7%(4/6)和16.7%(1/6)。胰腺导管腺癌的K-ras 12密码子突变量及阳性率与胰腺腺鳞癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤差异无统计学意义，而较胰腺黏液腺癌、内分泌癌、胰腺良性疾病显著增加(P值均<0.05)。通过接受者操作特征(ROC)曲线分析，胰腺导管腺癌K-ras 12密码子突变的曲线下面积为0.727，诊断胰腺导管腺癌的敏感性及特异性分别为84.8%、64.0%。胰腺导管腺癌的K-ras基因第12密码子突变量与患者生存期显著相关。胰腺导管腺癌的K-ras 13密码子突变量及阳性率与其他胰腺疾病的差异无统计学意义。结论K-ras12密码子基因突变对胰腺癌有较好的鉴别诊断及患者预后判断价值。

胰腺肿瘤； K-ras基因； 密码子； 点突变； 诊断

材料与方法

一、材料

收集2006年8月至2010年4月我院手术治疗的胰腺疾病相关患者130例。其中男性82例，女性48例，年龄30～80岁，平均(59±9)岁，中位年龄60岁。所有患者临床资料完整，术前均未进行化疗和放疗。所有病例均通过手术切除标本、活检或穿刺组织标本的病理学检查确诊；病理检查未见癌细胞，经18～29个月随访证实无癌变，确诊为良性病变。

二、K-ras突变的定量检测

取约50 mg组织，采用酚-氯仿提取法抽提组织DNA。使用NanoDrop核酸微量测量仪(ND1000型)测定DNA样本浓度，根据A260/A280比值判定其纯度。采用肽核酸钳制实时荧光定量PCR法检测K-ras 12、13密码子突变量。K-ras 突变量为125 ng DNA中检测的突变拷贝数，突变量>100拷贝为K-ras突变阳性，K-ras突变阳性率=K-ras突变阳性例数/总检测例数。

三、资料分析与统计

采用SPSS16.0统计软件进行统计分析。突变量呈偏态分布，用中位数及四分位数表示。两组间突变量的比较采用Mann-WhitneyU检验。通过接受者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)判断阳性截止值。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、胰腺组织病理诊断

130例组织中胰腺导管腺癌105例，胰腺腺鳞癌8例，胰腺黏液腺癌2例，内分泌癌3例，十二指肠及壶腹部恶性肿瘤6例，胰腺良性疾病6例。

二、各种胰腺疾病K-ras 12、13密码子突变量

胰腺导管腺癌、腺鳞癌、黏液腺癌、内分泌癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤、胰腺良性疾病的K-ras12密码子突变量的中位数及四分位数分别为4062(495，10800)、238(45,8420)、15(9,21)、3(3,16)、2283(73,5037)和21(8,56)；突变阳性率分别为84.8%(89/105)、50.0%(4/8)、0、0、66.7%(4/6)和16.7%(1/6)。胰腺导管腺癌的K-ras 12密码子突变量和突变阳性率与胰腺腺鳞癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤比较，差异无统计学意义(P值均>0.05)，而较胰腺黏液腺癌、内分泌癌、胰腺良性疾病的突变量及突变阳性率显著增加，差异具有统计学意义(P值分别为0.04、0.00、0.02)。

37例胰腺导管腺癌、7例胰腺腺鳞癌、2例胰腺黏液腺癌、3例内分泌癌、6例十二指肠及壶腹部恶性肿瘤、6例胰腺良性疾病检测了K-ras 13密码子突变量。其中位数及四分位数分别为9(0,245)、14(0,140)、414(1,827)、3(2,4)、370(0,598)和6(4,106)；突变阳性率分别为40.5%(15/37)、28.6%(2/7)、50.0%(1/2)、0、66.7%(4/6)和33.3%(2/6)。胰腺导管腺癌的K-ras 13密码子突变量和突变阳性率与其他5种疾病比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

三、K-ras 12、13密码子突变量的ROC分析

胰腺导管腺癌、腺鳞癌、黏液腺癌、内分泌癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤、胰腺良性疾病的K-ras12密码子突变的AUC分别为0.727、0.651、0.962、0.946、0.700和0.784。胰腺导管腺癌的K-ras 12密码子突变的AUC与胰腺腺鳞癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤比较，差异无统计学意义(P值分别为0.155、0.100)，而较胰腺黏液腺癌、内分泌癌、胰腺良性疾病的AUC显著减少，差异具有统计学意义(P值分别为0.026、0.009、0.020)。

以K-ras12密码子突变量100拷贝为阳性截止值时，诊断胰腺导管腺癌的敏感性为84.8%，特异性为64.0%，阳性预测值为90.8%，阴性预测值为50.0%，约登指数为0.488。

胰腺导管腺癌、腺鳞癌、黏液腺癌、内分泌癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤、胰腺良性疾病的K-ras13密码子突变的AUC分别为0.563、0.544、0.027、0.568、0.335和0.495。胰腺导管腺癌与其他5种疾病的差异均无统计学意义(P值分别为0.712、0.110、0.750、0.236、0.972)。

四、K-ras 12、13密码子突变量及突变阳性率与胰腺导管腺癌临床病理特征间的关系

K-ras 12、13密码子突变量及突变阳性率与患者年龄、性别、饮酒及肿瘤大小、部位、分化程度、淋巴结转移、临床分期、CEA和CA19-9水平等临床病理参数均无相关性。K-ras基因13密码子突变量及突变阳性率与患者吸烟、饮酒有关(P值均<0.05，表1)。

五、胰腺导管腺癌中K-ras基因突变与患者生存期的关系

以K-ras12 密码子突变量>100拷贝为阳性，则突变阳性患者的中位生存期为285 d(95%CI206.6～363.0)；阴性患者的中位生存期为573 d(95%CI322.4～823.5)，两组差异无统计学意义(P=0.081)。以K-ras12 密码子突变量>9500拷贝为高突变量组，则高突变量患者的中位生存期为224 d(95%CI180.5～267.5)，低突变量患者的中位生存期为398 d(95%CI329.1～466.9)，高突变量患者的生存期较低突变量患者显著缩短(P=0.03)。

表1 K-ras 12、13密码子突变量及突变阳性率与胰腺导管腺癌临床病理特征的关系

以K-ras13 密码子突变量>100拷贝为阳性，则突变阳性患者的中位生存期为285 d；阴性患者的中位生存期为254 d(95%CI322.4～823.5)，两组差异无统计学意义(P=0.70)。以K-ras13 密码子突变量>140拷贝为高突变量组，则高突变量患者的中位生存期为285 d(95%CI180.5～267.5)，低突变量患者的中位生存期为254 d(95%CI329.1～466.9)，两组差异无统计学意义(P=0.70)。

讨 论

K-ras基因突变的检测方法多样，传统的DNA直接测序法可检出10%的K-ras突变，常用的PCR-RFLP方法仅能检出0.5%～5%的K-ras突变，扩增受阻突变体系法(RMS)能测出约1%左右的K-ras突变[5]。近年来出现的PCR酶联分析、高分辨率溶解分析等方法不仅能够检测到K-ras基因的突变，并且能够进行半定量，但存在耗时较长、操作较繁琐、结果不稳定、假阳性高等不足之处。本研究采用双荧光标记探针联合肽核酸钳制实时定量PCR法检测K-ras基因12、13密码子点突变量，较之以前的以终点法进行定量的PCR技术具有操作简便、快速高效、在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增、敏感性和特异性高、不易受污染等长处，而且由于应用了荧光探针，可以直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化。

K-ras 基因突变可见于胰腺癌、胰腺癌前病变、慢性胰腺炎等组织[6]。文献报道，在胰腺癌与胰腺非恶性疾病(包括慢性胰腺炎、胰腺乳头状黏液瘤等)患者的组织或胰液中，K-ras的突变量存在明显差异[7-9]，在慢性胰腺炎及胰腺乳头状黏液瘤患者中检测到K-ras基因的异常提示其恶变倾向性更高[10]。Tada等[11]采用K-ras突变定量方法检测胰腺癌与胰腺良性疾病,结果显示胰腺癌的K-ras突变量高于胰腺良性病变。本研究结果显示，胰腺导管腺癌的K-ras 12密码子突变量高于胰腺良性病变，与文献报道的结果一致。但胰腺导管腺癌与胰腺腺鳞癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤的K-ras 12密码子突变量的差异无统计学意义，而与胰腺黏液腺癌、内分泌癌的突变量的差异有统计学意义，这种现象尚需加大样本量进一步验证。

本研究结果显示，K-ras 12密码子突变量与患者年龄、性别、饮酒及肿瘤大小、部位、分化程度、淋巴结转移、临床分期等临床病理特征均无明显相关性，提示K-ras 12密码子突变是胰腺导管腺癌发生的早期分子事件。本研究结果还显示，K-ras 12密码子突变与胰腺导管腺癌患者的生存期相关，是提示患者预后的潜在指标。但K-ras 13 密码子的突变对胰腺癌的鉴别诊断及预后价值不大。

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SignificanceofquantitativelydetectingK-rascodon12and13mutationsinthetissuesofpancreaticcancerandrelatedpancreaticdiseases

ZHUYan-ping,LIQuan-jiang,GAOJun,GUJun-jun,HUANGHao-jie,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo investigate the clinical significance of quantitative detection of K-ras codon 12 and 13 mutations in the tissues of pancreatic cancer and related pancreatic diseases.MethodsOne hundred and thirty samples from surgically removed pancreatic tissue with a conclusive pathological diagnosis (105 cases of pancreatic ductal adenocarcinoma, 8 cases of pancreatic adenosquamous carcinoma of the pancreas, 2 cases of pancreatic mucinous adenocarcinoma, 3 cases of pancreatic endocrine carcinoma, 6 cases of duodenal and papillary adenocarcinoma and 6 cases of benign pancreatic diseases) were collected. Quantitative detection of K-ras codon 12 and 13 mutations was performed by the method of peptide nucleic acid-mediated PCR clamping with two different fluorescence labeled probes. Mutation number >100 copies was used as the criteria to calculate the positive mutation rate.ResultsThe median and quartile of K-ras codon 12 mutations of pancreatic ductal adenocarcinoma, adenosquamous carcinoma of the pancreas, pancreatic mucinous adenocarcinoma, pancreatic endocrine carcinoma, duodenal and papillary adenocarcinoma and benign pancreatic diseases were 4062 (495, 10800), 238 (45, 8420), 15 (9, 21), 3 (3, 16), 2283 (73, 5037) and 21(8, 56), and the positive mutation rates were 84.8% (89/105),50.0% (4/8), 0, 0, 66.7% (4/6) and 16.7% (1/6). The quantity of K-ras codon 12 mutation in pancreatic ductal adenocarcinoma was not statistically different from those of adenosquamous carcinoma, duodenal and papillary adenocarcinoma, but it was significantly higher than those in pancreatic mucinous adenocarcinoma, pancreatic endocrine carcinoma, and benign pancreatic diseases (P<0.05). The area under ROC of K-ras codon 12 mutation in pancreatic ductal adenocarcinoma was 0.727. The sensitivity and specificity of the K-ras codon 12 mutation for the diagnosis of pancreatic ductal adenocarcinoma were 84.8%, 64.0%, respectively. The quantity of K-ras codon 12 was associated with survival of patients with pancreatic ductal adenocarcinoma. The quantity of K-ras codon 13 mutations and the positive mutation rates in pancreatic ductal adenocarcinoma was not statistically different from other pancreatic diseases.ConclusionsThe quantity of K-ras codon 12 mutation has good differential diagnostic and prognostic prediction value for pancreatic ductal adenocarcinoma.

Pancreatic neoplasms; K-ras gene; Codon; Point mutation; Diagnosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.009

国家自然科学基金(30910103911)；上海市重点科技攻关项目(11441901800)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

多项研究表明，胰腺癌的发生与K-ras基因突变密切相关[1]。K-ras突变多表现为12密码子的点突变，其次为13密码子点突变。但K-ras基因第12密码子点突变在部分胰腺外分泌良性肿瘤、慢性胰腺炎及胰腺非典型性增生组织中也可检测到[2]。文献报道，K-ras突变诊断胰腺癌的敏感性为0～100%，特异性为58%～100%。我科实验室前期已通过肽核酸钳制实时荧光定量PCR法检测K-ras 12、13密码子的突变[3-4]，本研究旨在验证其临床诊断价值，并评价其对判断患者预后的指导意义。

2012-05-07)

(本文编辑：屠振兴)