联合应用siRNA抑制HBVcccDNA的实验研究

李静红，武立刚，周亚丹，崔 颖，李桂秋

（1.齐齐哈尔医学院附属三院，黑龙江 齐齐哈尔161000；2.哈尔滨医科大学第一临床医学院 微生物科）

RNA干扰是细胞利用21－23nt双链RNA介导的转录后同源m RNA沉默的现象［1］。由于具有高度特异性和有效性，RNA干扰被广泛用于HIV、HCV、流感病毒等功能性基因的研究中。基于逆转录环节在HBV复制中的重要作用，一些学者已经证实RNA干扰可以通过沉默病毒基因来抑制HBV复制［2，3］，这为抗 HBV 慢性感染提供了一种新的方法。我们曾经报道过针对HBV核定位信号区的小干扰RNA（siRNA）能够有效抑制 HBV DNA复制和ccc DNA扩增［4］。因为 HBV感染是多基因参与的细胞内感染过程，我们认为联合使用siRNA能够发挥更强的抗HBV作用。在本实验中，我们在Hep G2.2.15细胞中联合应用siRNA来抑制HBV复制。实验结果表明联合应用siRNA比单独应用siRNA产生更强烈的抑制HBV复制作用，特别是对cccDNA的抑制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 （DMEM）和G418购自美国GIBCO公司。Hep G2.2.15细胞为本实验室保存。质粒psi／U6由武汉晶赛公司提供。PCR引物由上海博雅 生物公司合成。Trizol，M－MLV 逆转录酶，Lipofection 2000购自美国Invitrogen公司。所用限制性内切酶购自NEB公司。

1.2 构建质粒表达载体 我们在质粒psil／U6的Bam HⅠ－HindⅢ位点之间插入一段21nt的编码相应siRNA的特异序列构建了HBVsiRNA的表达载体，并进一步通过BLAST分析为未发现同源序列。引物序列如下：siRNA1：5’－AAGATCTCAATCTCGGGAATC－3’；siRNA2：5’－CAGGTCCCCTAGAAGAAGAAC－3’；无关对照质粒HK：5’－ACTACCGTTGTTATAGGTG－3’。重组质粒通过酶切和DNA序列分析加以鉴定。

1.3 细胞培养和转染 Hep G2 2.2.15细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中（含青霉素100 U／ml，链霉素100μg／ml，200μg／ml G418），37℃ ，体积分数为5%CO2的孵箱中培养。转染前24小时将细胞置于6孔板培养，4μg表达相应siRNA的质粒与脂质体Lipofectamine 2000按说明书步骤共转染，每24小时更换培养液，分别于48、72、96小时收集细胞做进一步分析，实验分为5组，每组设3个复孔。

1.4 检测 用ELISA方法测定48、72、96小时细胞培养上清中HBs Ag and HBeAg的表达，按说明书进行。

1.5 HBV mRNA的检测 分别于48、72、96小时用Trizol法从细胞中提取RNA，用M－MLV逆转录酶进行逆转录反应。PCR循环参数如下：先在94℃变性3 min，然后按下述条件循环30次，变性94℃15 s、退火52℃30 s、延伸72℃30 s，最后72℃延伸10 min结束反应。PCR引物如下：HBV上链引物：5’－ACCTCTGCCTAATCATCTC－3’下链引物：5’－GTAAGACAGGAAATGTGAAAC－3’；β－actin 上链 引 物 5′－GTCGGTGTGAACGGATTT－3′GAPDH下链引物5′－ACTCCACGACGTACTCAGC－3′。PCR扩增产物用1.2%的琼脂糖进行电泳分析。

1.6 HBV DNA和cccDNA的检测 分别于48、72、96小时从培养上清和细胞中提取HBVDNA和cccDNA进行实时定量PCR检测，按说明书进行。

1.7 统计学方法 采用SPSS12.0软件，统计处理以每组3个复孔测定值的表示，组间比较用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBsAg和HBeAg的抑制作用 用ELISA方法测定48、72、96小时细胞培养上清中HBe Ag和HBs Ag的表达，HBe Ag和HBs Ag的浓度。如图1所示，在各个时段，无关对照组对 HBs Ag和HBe Ag的表达与空载体组相比无明显差异（P＜0.05），说明RNAi作用是特异的。在各个siRNA治疗组，HBs Ag和HBe Ag水平均有明显下降，转染96小时后联合应用siRNA组对HBs Ag和HBe Ag的抑制率最强（83.89% ，91.07%）与单独应用siRNA组相比均具有明显差异（P＜0.05）。

2.2 Hep G2 2.2.15细胞中 HBV mRNA的抑制作用 HBVmRNA水平用RT－PCR来检测，结果显示各个siRNA治疗组均能明显降低mRNA水平，空载体组对mRNA无抑制作用。在96小时联合应用siRNA组对mRNA的抑制率最强，几乎检测不到mRNA条带，抑制效果明显高于单独应用组（图2）。

图1 siRNA对HBsAg和HBeAg表达水平的抑制

2.3 HBV DNA的抑制作用 HBV DNA和cccDNA水平用实时定量PCR来检测，检测范围可以达到104－108拷贝。如图3所示，各个siRNA治疗组均能明显降低DNA水平，空载体组对DNA无抑制作用。在96小时，联合应用siRNA组病毒DNA拷贝数与对照组相比减少88.6%，抑制作用明显高于单独应用siRNA组（P＜0.05）。转染96小时后，各个siRNA治疗组cccDNA水平分别下降50.4%（siRNA1），22.31%（siRNA2），69.83%（siRNA1＋2）。可见，联合应用siRNA组对cccDNA的抑制作用明最强，明显高于单独应用siRNA组（P＜0.05）。

图3 siRNA对HBV DNA和cccDNA水平抑制

3 讨论

RNA干扰技术为治疗HBV感染提供了新的有效方法。据报道，单独应用合成的siRNA治疗HBV、HCV、HIV时，会引起病毒突变。为了解决这一问题，用针对病毒基因组的不同位点设计多个siRNA和选择相对保守的区域。联合疗法可最大限度的降低病毒载量，成为治疗HBV感染的新方法［5，6］。我们在 Hep G2 2.2.15细胞中检测联合应用siRNA的抗病毒效果，并与单独应用siRNA进行了比较。因为HBV感染是多基因参与的细胞内感染过程，联合使用siRNA能够同时阻断病毒基因的多个位点，使病毒难以修复，发挥更强的抗HBV作用。

Hep G2.2.15细胞是由头尾相接的 HBV－DNA转染人肝癌细胞株 Hep G2细胞而建立的，该细胞株能长期稳定地向培养上清液中分泌病毒蛋白和完整的病毒颗粒，还能产生大量的病毒复制中间体，更接近于HBV自然感染状态。本实验针对HBV核定位信号区的特异性siRNA被转染入Hep G2.2.15细胞中，并对各种指标进行监测。结果显示，HBs Ag、HBeAg、mRNA水平都受到抑制；同时，real－time PCR结果显示，DNA和cccDNA水平也明显下降，这种抑制作用具有高度选择性、特异性、剂量依赖性的特点。在本实验中，应用的各siRNA治疗组均能明显抑制HBV复制，其中联合应用siRNA组对HBV的抑制作用最强，抑制效果明显高于单独应用siRNA组。

［1］Hammond S M，Bernstein E，Beach D.An RNA－directed nuclease mediates post－transcriptional gene silencing in Drosop cells［J］.Nature，2000，404：293.

［2］Wu HL，Huang LR，Huang CC，et al.RNA interference－mediated control of hepatitis B virus and emergence of resistant mutant［J］.Gastroenterology，2005，128：708.

［3］Uprichard SL，Boyd B，Althage A，et al.Clearance of hepatitis B virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：773.

［4］Li GQ，Gu HX，Li D，et al.Inhibition of Hepatitis B virus cccDNA replication by siRNA［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，355：398.

［5］Li GQ，Xu WZ，Wang JX，et al.Combination of small interfering RNA and lamivudine on inhibition of human B virus replication in Hep G2.2.15 cells［J］.Word Journal of Gastroenterology，2007，16：708.

［6］Colledge D，Civitico G，Locarnini S，et al.In vitro antihepadnaviral activities of combinations of penciclovir，lamivudine，and adefovir［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44：551.