一种灵长类动物帕金森病模型行为检测方法

刘玉军 鲁 强 陈庆友 张进禄

(首都医科大学北京神经科学研究所，北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失为主要病理特征的一种神经退行性疾病，临床表现主要有静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势反射障碍等［1-2］。PD多在40岁以后发病，随着老龄化日益加重，其发病率呈现出明显上升趋势［3-5］。研究显示PD发展过程中的行为改变表现出慢性进展的特点，这与多巴胺能神经元发生慢性进行性退变有关［1-7］。目前，有关PD模型实验大部分来自于啮齿类低等动物模型，缺乏高等灵长类动物试验［5-8］，其原因是对高等灵长类动物PD模型行为学变化缺乏客观有效的评价方法［9-10］。Gash D M等［10］利用计算机模-数转换技术开发出猴运动检测平台(monkey motor assessment panel 2000，mMAP2000)，此方法可以定量检测及分析人及灵长类动物上肢运动行为，研究结果显示随着年龄的增长上肢运动的精确性降低。本课题组将上述技术应用于灵长类(恒河猴)PD动物模型行为学定量检测，发现本方法受观察者主观意见干扰小，是一种科学准确的行为学定量方法。现将本方法实验过程简述如下，以供借鉴。

1 实验仪器设备要求及工作原理

实验场地要求空间较大、无噪音、无其他人员走动、自然光充足。计算机系统配置要求:CPU2奔腾Ⅲ500 MHz或更高;内存128 MB或更高;硬盘空间1 GB以上可用硬盘空间;操作系统Windows 98、2000或XP［5］。此方法的工作原理为:实验笼具前方设有取食平台，在实验笼具和取食平台截面分设X和Y两个取食口，每个取食口安装监控装置，当实验动物取食过程中上肢通过每个取食口时，监控装置通过光电二极管实现模-数信号转换，并将数字信号传输入电脑，运动监控程序记录并分析实验动物运动信息(图1)。

图1 猴运动检测平台及前臂取食实验的模式图Fig.1 A diagram of the mMAP and the animal to set and view the reward in the receptacle chamber during testing

2 PD动物模型的制备

PD动物模型的制备方法同以往研究报道［7］。简述如下:恒河猴术前禁食禁水24 h，戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔注射麻醉。将耳棒的尖端插入骨性外耳道口，以上颌托将上颌抬起，压眶板压住双侧眶下缘最低点确定3个平面垂直。固定后，剃去猴头顶部毛发，碘酊消毒并铺巾。以耳间连线前10 mm正中线右侧旁开5 mm，作长约3 cm的矢状切口。将头皮和骨膜向两侧牵开，用颅骨钻钻出一直径8 mm的骨窗，以尖针刺破硬脑膜。立体定向仪校正0点后，以Hamilton微量进样器每次抽取20 μL(2.5 g/L)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)溶液或同体积0.9%氯化钠注射液，根据Paxinos恒河猴脑立体定位图谱确定黑质内两个靶点注射，第一点坐标为耳间线前10.2 mm，正中线右旁开3.5 mm，硬脑膜下39 mm;第二点坐标为耳间线前8.4 mm，正中线右旁开5.0 mm，硬脑膜下37 mm。每点注射时间为20 min，留针15 min。注射结束后，头部伤口以3%双氧水和庆大霉素0.9%氯化钠注射液冲洗，缝合骨膜和头皮，放回饲养笼内，庆大霉素1 mg肌肉注射，密切观察术后动物的体温、体质量、饮食饮水，排泄情况。

3 上肢活动的检测

在测试前，对动物进行4～6周的适应训练，让其熟悉测试装置。待动物能够从猴上肢运动测试仪的平台上自由抓取食物后，进入正式实验。该测试装置是通过多个二极管构成的感应器将上肢经过不同位置的信号记录并传输到计算机后，运行程序分析获得的数据。测试时将装置固定于观察笼的门前，猴通过两个直径为8.5 cm的取食口，将放置于平台上的食物取走(图2)，该装置被用于人类和猴上肢活动的定量检测。实验检测左右上肢取食活动，每侧各为6次，记录每次所需时间，取均数为每时间点观察值，测试均在每日上午10点进行。实验过程中分别记录手术前、手术后4周、8周、16周、24周、36周、48周猴前臂取食运动时间和手爪抓取食物所用的时间，分别对右臂和左臂上肢活动术后各时间点与手术前比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

图2 前臂取食实验图示Fig.2 A photo showing the animal in the receptacle chamber during testing

4 疾病模型行为变化的结果分析

术后动物表现出右侧上肢运动无明显变化，左侧上肢运动变得迟缓，手爪抓取食物时出现不稳、吃力、灵活度下降，在术后48周时行为改变更为明显。

4.1 前臂活动速度的改变

结果显示，模型动物LPS注射对侧上肢(左臂)术后取食时间表现出不同程度的延长，随时间的推移出现增加的趋势。在术后24周，注射左侧前臂取食时间与术前自身相比分别延长了30.8%;在术后36和48周，注射左侧前臂取食时间分别延长了76.5%(P ＜0.01)和50%(P ＜0.01);而注射 LPS的各动物同侧肢体(右臂)前臂取食时间各时间点的差异没有统计学意义(P＞0.05)(图3)。

图3 猴前臂运动时间Fig.3 A diagram of monkey’s forearm movement time

4.2 手爪精细活动的改变

注射LPS对侧(左侧)手爪抓取食物所需时间延长，并出现抓取食物不稳、吃力、抖动，行为改变随着时间推移而加重。术后24周左侧手爪取食时间延长了41.2%;术后36和48周，对侧手爪取食时间分别延长了81.8%(P ＜0.01)和 55.6%(P ＜0.01);而各动物在注射LPS后同侧(右侧)手爪取食时间各时间点差异无统计学意义(图4)。

图4 猴手爪取食运动时间Fig.4 A diagram of the monkey’s hand movement times

5 讨论

PD为多巴胺神经元进行性丢失，肢体运动障碍进行性加重为临床表现的神经变性疾病［1-7］。一直以来，PD模型多以啮齿类模型为主，啮齿类模型的行为学检测已经有自主活动计数、游泳实验、爬杆实验和悬挂实验等多种方法［4-6，8］。但对高等动物模型行为学评价多采用评价量表的方法，这种评价方法受观察者主观意见干扰影响大，很难对行为变化进行客观的定量评价［9-10］。本研究显示mMAP2000系统可以对高等动物模型的大体运动行为活动做定量分析，疾病模型的病程进展过程中，出现上肢不同程度的运动距离减少和运动速度下降等行为学变化，并随着时间的推移而逐渐加重，呈现进行性呈慢性进展的特点，符合帕金森病慢性进行性加重的疾病进展特点。因此，本文介绍的mMAP2000系统利用计算机模-数转换技术记录和定量分析取食过程中上肢运动行为，可有效地去除人为因素的干扰，更加客观反映动物上肢运动行为的变化，是适用于大型动物(灵长类)PD模型的行为学检测方法。

［1］ZhaoJ， Xu Q. Emerging restorative treatments for Parkinson＇s disease:manipulation and inducement of dopaminergic neurons from adult stem cells［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2011，10(4):509-516.

［2］Ponsford J R. Therapies for dopaminergic-induced dyskinesias in Parkinson disease［J］.Ann Neurol，2011，70(4):667.

［3］Zhang J，Stanton D M，Nguyen X V，et al.Intrapallidal lipopolysaccharide injection increases iron and ferritin levels in glia of the rat substantia nigra and induces locomotor deficits［J］.Neuroscience，2005，135(3):829-838.

［4］Dauer W，Przedborski S.Parkinson’s disease:mechanisms and models［J］.Neuron，2003，39(6):889-909.

［5］Choi D Y， ZhangJ， BingG. Agingenhancesthe neuroinflammatory response and alpha-synuclein nitration in rats［J］.Neurobiol Aging，2010，31(9):1649-1653.

［6］霍洁，鲁强，孙晓红，等.大鼠苍白球炎症反应后黑质铁代谢的改变［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11(8):1489-1496.

［7］户乃丽，刘玉军，徐群渊，等.黑质内炎症反应对恒河猴多巴胺能神经元的毒性作用［J］.解剖学报，2009，40(5):732-736.

［8］Jingzhong Z，Hui Y，Devi D，et al.Long-term therapeutic effects on parkinsonian rats of intrastriatal co-grafts with genetically engineered fibroblasts expressing tyrosine hydroxylase and glial cell line-derived neurotrophic factor［J］.Int J Neurosci，2005，115(6):769-779.

［9］张进禄，刘玉军，鲁强，等.单侧颈内动脉注入MPTP建立偏侧帕金森病灵长类模型的研究［J］.首都医科大学学报，1998，19(1):1-4.

［10］Gash D M，Zhang Z，Umberger G，et al.An automated movement assessment panel for upper limb motor functions in rhesus monkeys and humans［J］.J Neurosci Methods，1999，89(2):111-117.