分光光度法测定仙鹤草总酚含量的方法研究

李 倩 刘子衿 叶燕彬 夏 颖 张 枫*

(1.首都医科大学基础医学院，北京 100069;2.首都医科大学化学生物学与药学院，北京 100069)

仙鹤草为蔷薇科植物龙芽草(agrimonia pilosa ledeb)的地上部分，具有收敛止血、截疟、止痢、解毒等作用，现代药理学研究［1］表明其具有较强的抗肿瘤活性。仙鹤草全草中含有仙鹤草素、仙鹤草内酯、甾醇，还含有鞣质、黄酮、仙鹤草酚等多种多酚类物质［2-5］。植物多酚是广泛存在于植物体内的多羟基酚类化合物的总称，是植物的次生代谢产物，具有良好的抗氧化、抗诱变、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等多方面作用。于莉等［5-7］的研究已证明仙鹤草多酚具有抗氧化作用，而且仙鹤草的抗肿瘤作用很可能是利用了仙鹤草活性成分中的抗氧化作用。随着对仙鹤草多酚类物质研究的深入，寻找能够准确定量测定其多酚的方法是非常必要的。

本研究采取Folin-Ciocalteus法，对仙鹤草中多酚含量的测定条件进行了多方面的实验，并对所确定的实验条件从方法学的稳定性、精确性、重复性、回收率等方面进行了考察和验证。希望本研究所建立的测定方法能为仙鹤草多酚的定量研究以及开发利用提供帮助。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

1)仪器:VIS-7220型-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);BSZ型电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);FZ102微型植物式样粉碎机(河北黄骅市齐家务科学仪器厂);HH-601超级恒温循环水浴(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);TGL-16高速台式离心机(上海医用分析仪器厂);KQ-50B型超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)。

2)药品材料:没食子酸(中国药品生物制品检定所，批号110831-200803);Folin-Ciocalteus试剂(简称FC试剂，德国Merck公司);其他试剂为分析纯;水为蒸馏水;仙鹤草购自北京市天天好大药房。

1.2 研究方法

1)标准溶液和样品溶液的制备:准确称取没食子酸5.19mg，用蒸馏水定容于50mL容量瓶中，此为0.104g/L没食子酸标准溶液。

将干燥后的仙鹤草加入粉碎机中粉碎，并过40目筛，按固液比为1∶30(kg/L)，用60%的乙醇超声波提取20min。将提取液转移到离心管中，在转速1 200r/min离心6min，留取上层清液，此为仙鹤草样品溶液。

2)测定波长的选择:分别定量移取没食子酸标准溶液和仙鹤草样品溶液于10mL的容量瓶中，依次加入2mL蒸馏水，0.5mL FC试剂，1.5mL 20%Na2CO3溶液，用蒸馏水定容。放置60min后，以空白为对照，分别用分光光度计在400～800nm范围内进行扫描，选择最大吸收波长。

3)显色温度和时间的考察:取没食子酸标准溶液0.3mL于10mL容量瓶中，按照1.2中2)项下方式加入显色剂，定容后分别放置在 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃恒温水浴中加热反应90min，然后测定760nm和660nm处的吸光度，考察反应温度对比色效果的影响。

另取0.3 mL没食子酸标准溶液于10 mL的容量瓶中，按照1.2中2)项下方式加入显色剂并开始计时。分别在放置 15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180 min时，测定760 nm 和660 nm 处的吸光度，考察反应时间对比色效果的影响。

4)FC试剂和碳酸钠用量的考察:取没食子酸标准液 0.6 mL，分别加入 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2 mL 的FC 试剂，1.5 mL 的20%碳酸钠溶液，并定容于10 mL容量瓶中，室温反应90 min后测定760 nm和660 nm处的吸光值，确定当20%碳酸钠用量一定时的FC试剂用量。

另取没食子酸标准液0.6 mL，加入0.5 mL的FC试剂，分别加入 0.5、0.8、1.2、1.5、1.8、2.1、2.5、3.5 mL的20%碳酸钠溶液，并定容于10 mL容量瓶中，室温反应90 min后测定660 nm和760 nm处的吸光值，确定当FC试剂的用量一定时，20%碳酸钠试剂的用量。

2 结果

2.1 测定波长的确定

从图1和图2的吸收曲线可知，显色后没食子酸和仙鹤草样品在750～770 nm，650～700 nm处有吸收峰。因此本实验选用760 nm和660 nm为其测定波长。

2.2 显色温度和时间的确定

由图3可知，在760 nm和660 nm处，随着温度的升高，吸光度有逐渐降低的趋势，选择室温25℃为实验温度。

由图4可知，在加入显色试剂显色60 min以后，吸光度在760 nm和660 nm处吸光度基本保持稳定，本实验选择90 min为测定时间。

2.3 FC试剂和碳酸钠用量的确定

由图5可知，当固定碳酸钠用量，吸光度大小随FC试剂量的增加有缓慢的增加，考虑到FC试剂过量后本身的吸收及试剂成本，FC试剂量不是愈大愈好。由图6可知，当固定FC试剂用量，20%碳酸钠用量在1.0～1.8 mL内吸光度基本稳定，由于FC试剂与酚类物质反应要在碱性介质条件下进行，如加入的碱量少，显色反应会不完全。结合这2个实验结果，本实验选定FC试剂用量为0.5 mL，20%Na2CO3用量为1.7mL。

2.4 标准曲线的建立

按所确定的实验方法，准确移取0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL没食子酸标准溶液于10 mL容量瓶中，加入2 mL蒸馏水，0.5 mL FC试剂，1.7 mL 20%Na2CO3溶液，用蒸馏水定容，室温放置90 min后，在760 nm和660 nm处分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，总酚浓度为横坐标，绘制标准曲线，760 nm时的回归方程为y=0.091 8x+0.012 9，R2=0.999 3见图7;660 nm时的回归方程y=0.084 7x－0.002 6，R2=0.999 7。且均在0～10.4 mg/L有良好的线性关系，详见图8。

2.5 方法评价

1)稳定性实验:取仙鹤草样品溶液，按所确定的方法加入显色剂后，每隔15 min测量1次吸光度。180 min内在760 nm的吸光度变化情况为:0.425、0.435、0.437、0.437、0.438、0.438、0.438、0.438、0.438、0.438、0.440、0.438，RSD 为0.9%。在660 nm的吸光度变化情况为:0.379、0.391、0.392、0.393、0.392、0.394、0.394、0.395、0.394、0.395、0.395、0.395，RSD为1.1%。该实验方法对于仙鹤草样品在3h之内吸光度是稳定的。

2)重现性实验:取同1批仙鹤草样品5份，按所确定的方法测定吸光度，在760 nm的吸光度为0.446、0.449、0.450、0.442、0.444、0.442，RSD 为0.8%。在660 nm的吸光度为0.400、0.405、0.406、0.400、0.400、0.393，RSD 为 1.6%。

3)精密度实验:取1份仙鹤草样品，按所确定的方法测定吸光度，重复测定6次，在760 nm测定其吸光度为 0.421、0.431、0.441、0.434、0.437、0.435，RSD为1.6%。在660 nm测定其吸光度为0.380、0.390、0.397、0.389、0.396、0.387，RSD 为 1.6%。

4)加标回收率实验:采用加标回收实验，将已知量的没食子酸样品，分别加入已知总酚含量的仙鹤草样品中，按上述所确定的方法进行测定，计算回收率，结果详见表1。

表1 仙鹤草加标回收率实验结果Tab.1 Result of recovery of added standard to agrimonia pilosa ledeb

2.6 仙鹤草总酚含量测定

按上述方法制备及测定的7份夏枯草样品，计算每100克仙鹤草中含有多酚的量分别为:在760 nm处其总酚平均值为4.70 g/100g，RSD为1.0%;在660 nm处总酚平均值为4.75 g/100 g，RSD为1.2%。

3 结论

天然多酚类物质在植物中广泛存在，不仅种类和数量繁多，而且存在的形式既复杂又多种多样。所以针对不同的天然物质中的多酚，测定方法可以有多方面选择，如可采用Folin-Ciocalteus法、Folin-Denis法、铁氰化钾法、酒石酸亚铁法等［8-9］。本文以没食子酸为对照品，采用Folin-Ciocalteus法测定仙鹤草中的多酚含量。实验结果表明，在所选定的实验条件下，无论是采用吸收波长760nm还是660nm，本实验所建立的测定仙鹤草中总多酚含量的方法，在稳定性、精密性、重复性以及回收率方面都有很好结果，可以为仙鹤草总多酚定量分析的研究方法提供参考。

［1］阳向波.仙鹤草的现代药理研究进展及临床研究应用［J］.时珍国医国药，2003，14(12):780.

［2］刘红霞，刘召喜，姜清华，等.仙鹤草的酚类化学成分［J］.沈阳药科大学学报，2010，29(4):286-289.

［3］贺成，秦文杰，唐晓晶，等.仙鹤草地上部分仙鹤草酚B的分离与鉴定［J］.中草药，2011，42(2):255-256.

［4］潘娅，刘红霞，庄玉磊，等.仙鹤草中黄酮类化学成分研究［J］.中国中药杂志，2008，33(24):2925-2928.

［5］于莉，金哲雄.仙鹤草中鞣质成分的抗氧化作用［J］.黑龙江医药，2008，22(5):625-627.

［6］祝连彩，王伯初，谭君，等.仙鹤草醇提取物极其不同极性部位的抗氧化活性研究［J］.中药材，2009，32(8):1272-1275.

［7］Zhua L C，Tan T，Wang B C，et al.Antioxidant activities of aqueous extract from agrimonia pilosa ledeb and its fractions［J］.Chem Biodivers，2009(6):1716-1726.

［8］杨佳林，朱青，孙丽萍，等.油菜蜂花酚类化合物含量测定方法的研究［J］.云南农业大学学报，2010，25(1):142-146.

［9］孙宏，张泽.分光光度法测定天然多酚类化合物含量的研究进展［J］.生物质化学工程，2008，42(3):55-58.