迟发性阿尔茨海默病患者血清尿激酶型纤溶酶原激活因子浓度的测定及其意义

向绍通 徐书雯* 李东风

(1.广东省人民医院东病区神经内科广东省医学科学院广东省老年医学研究所广东省神经科学研究所，广州 510080;2.广东省人民医院医学研究中心广东省老年医学研究所，广州 510080)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种常见的老年异质性脑神经退行性疾病，以进行性记忆和认知功能丧失为主要临床特征，是一种主要的老年痴呆症，其病理特征以老年斑和神经原纤维缠结为主。有文献报道［1-2］，医师如能在患者病理改变尚未达到不可逆阶段时进行早期干预治疗，可延缓或阻止病情发展，极大地减少AD对患者及社会的危害，故AD的早期诊断具有十分重要的意义。但到目前为止，还没有获得一个一致的、易重复的、敏感特异性均较高的理想生化标志物。β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的神经毒作用是多种因素导致AD发病的共同通路，血清尿激酶型纤溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一种类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，可将无活性的纤溶酶原转化为有蛋白水解酶活性的纤溶酶，后者可以降解聚集体或非聚集体形式的Aβ［3］，Alonso D F 等［4］研究发现，血浆纤溶酶循环的异常与痴呆的严重程度相关，尚不知血清uPA浓度与AD的关系如何，是否可作为AD早期诊断的生物学标志。

1 资料和方法

1.1 研究对象与纳入标准

纳入标准与分型:①迟发型阿尔茨海默病(lateonset Alzheimer's disease，LOAD)患者:根据美国国立神经病学、语言沟通障碍和卒中－老年性痴呆和相关疾病学会工作小组标准［5-6］中“很可能AD”的标准纳入，简易智能精神状态量表评分:文盲≤17分、小学文化≤20分、初中以上文化≤24分，临床痴呆评定量表≥1分，汉密顿抑郁量表评分＜7分，Hachinski缺血指数量表评分≤4分。患者为广东省人民医院东病区2004年～2007年的门诊及住院患者，均为汉族，迟发病例，相互间无血缘关系，共收集55例，男37例，女18例，年龄61～90岁，平均年龄(77.71±7.80)岁。根据临床痴呆评定量表评分将患者分为轻度、中度和重度:1分为轻度，2分为中度，3分为重度。轻、中、重度痴呆例数分别为27、15、13例。②对照组:为广东省人民医院同期体检人群中记忆及认知正常者，共61例，男43例，女18例，年龄66～86岁，平均年龄(75.63±5.10)岁，均为汉族，简易智能精神状态量表评分≥28分，汉密顿抑郁量表评分＜7;Hachinski缺血指数量表评分≤4分。年龄、性别均与LOAD组匹配。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

所有研究对象在获得同意后，抽全血后制备成血清及提取白细胞后储存于－70℃的冰箱。

1.2.2 血清uPA浓度测定

采用酶联免疫吸附法检测uPA浓度，试剂盒购自美国ASSAYPRO公司。血清样本用EIA Diluent稀释液按1∶2稀释3倍;向微孔加入50 μL标准品或血清样本，室温孵育2 h;按说明书依次洗板后加入生物素酰化uPA抗体、链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶结合物、铬精底物、中止液，最后用美国Bio-TEK公司的SvnergyTMHT多通道酶标仪于450 nm的波长读取溶液的吸光度。所测浓度×3即为血清uPA浓度。

1.2.3 Plau基因P141L多态性基因分型［7］

所有入组病例均采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术进行plau基因P141L多态性基因分型，PCR引物:5'-CTGGTTGAGTCTTCCCTGAG-3'及5'-CTGCCACTTCTTCCTTCCCT-3'，引物由日本TaKaRa公司合成。扩增产物用AluⅠ限制性内切酶进行酶切及电泳。

1.3 统计学方法

采用SASV8软件进行统计学分析。对于病例组与对照组的年龄构成和uPA浓度比较采用t检验，分层多组比较采用方差分析，对各组的性别构成进行χ2一致性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增及酶切产物的检测结果

基因型可根据等位基因的片段来判断:C/C型(野生型)为 729 bp;C/T 型为729 bp，594 bp，135 bp;T/T 型为 594 bp，135 bp，详见图1。

图1 Plau基因P141L多态位点PCR-RFLP电泳图谱Fig.1 PCR-RFLP electrophoregram of P141L polymorphic of plau gene

2.2 临床一般资料比较

LOAD组及对照组性别及年龄构成，差异均无统计学意义，性别比较:χ2=0.14，P=0.708 3;年龄比较:t=1.70，P=0.092 5，详见表1。

表1 LOAD组和对照组性别及年龄的比较Tab.1 Comparison of gender and age between LOAD group and control group

2.3 各组血清uPA浓度的比较

将LOAD组进一步分成轻度及中－重度两组，与对照组进行血清uPA浓度的比较，数据显示，中－重度LOAD组血清uPA浓度较轻度LOAD组及对照组血清uPA浓度低，但差异无统计学意义(F=0.85，P=0.469 9)，详见表2。

表2 LOAD组和对照组血清uPA浓度的比较Tab.2 Comparison of the concentration of uPA in serum between LOAD group and control group

2.4 Plau基因P141L多态性对血清uPA浓度的影响

将所有研究对象按基因型分为C/C、C/T、T/T 3组，3组血清uPA浓度比较，差异有统计学意义(F=4.89，P=0.009 2)，进一步进行两两比较分析，C/C组与C/T组差异无统计学意义;C/C组与T/T组以及C/T组与T/T组比较，差异均有统计学意义，结果表明，基因型C/C组及C/T组血清uPA浓度显著高于T/T组，详见表3。

表3 所有研究对象分C/C型、C/T型与T/T型3组血清uPA浓度的比较Tab.3 Comparison of the concentration of uPA in serum among the three genotypes from all subjects

3 讨论

uPA是一种类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，uPA与其特异受体相结合，可将无活性的纤溶酶原转化为有蛋白水解酶活性的纤溶酶。纤溶酶uPA与Aβ的降解密切相关:Ledesma M D等［8］研究表明，纤溶酶可以增加人β淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid protein precursor，APP)在α切割位点上的裂解过程，从而有效地降低Aβ的分泌。也有体外研究显示［9］，uPA可以抑制Aβ微纤维的形成，减少Aβ的沉积，从而降低Aβ的毒力。Davis J等［10］报道，Aβ可以刺激体外培养的人脑血管平滑肌(human cerebro-vascular smooth muscle，HCSM)细胞中纤溶酶原激活因子的表达，利用核糖核酸酶保护测定和纤溶酶原酶谱分析法可以发现上述过程中纤溶酶原激活因子的表达主要是uPA，并伴随uPAR表达的增加;在存在纤溶酶原的情况下，HCSM细胞中的Aβ被迅速降解，从而恢复细胞活力。因此可以认为，uPA表达的增加可以通过在局部降解或清除致病的Aβ来发挥对神经系统的保护作用，uPA的异常与AD的病理生理有着密切的联系。遗憾的是，本研究利用检测了LOAD患者及正常对照组外周血清uPA的浓度，结果显示LOAD组血清uPA的浓度和对照组差异无统计学意义，可以认为血清uPA浓度尚不能用来作为AD诊断的标志物。另外，本研究结果显示，轻度LOAD患者血清uPA的浓度较中－重度患者高，虽然差异无统计学意义，但可以看出随着AD患者病情的加重血清uPA的浓度呈递减的趋势。本课题研究人员分析此现象归纳原因有可能因为:①随着AD患者病情的发展，老年斑从只有少许类淀粉样纤维沉积的早期斑最后可以发展为中心有致密类淀粉核心的致密斑，随着AD的病理进展，Aβ在脑组织及血管中的沉淀不断增多。AD患者血浆 Aβ42浓度会随之下降［11］。②Tucker H M 等［12］通过在体外细胞培养以及APP转基因小鼠的研究发现，Aβ聚集体可以增加uPA的mRNA浓度。Davis J等［10］研究也显示Aβ可以刺激体外培养的人脑血管平滑肌细胞中uPA的表达。综上，随着血清Aβ浓度的下降，理论上血清uPA的浓度亦会随之下降。但近期有研究［13］结果显示，AD患者颅内的纤溶酶原激活因子的浓度并无改变，通过其抑制因子－1来降低纤溶酶原激活因子的活性。因此，尽管本研究显示LOAD组血清uPA的浓度和对照组差异无统计学意义，接下来仍有必要对LOAD患者血清uPA的活性进行研究。

uPA是由位于10号染色体的长臂上的plau基因编码，Ertekin-Taner N等［14］研究认为，位于 plau基因第6外显子上的错义C→T突变可使脯氨酸变为亮氨酸(P141L)，此突变可能是一个致病突变，可通过减少uPA的浓度，使Aβ42浓度的增加而发挥作用。本研究分析了plau基因P141L多态性对血清uPA浓度的影响，结果显示C/T组及C/C组血清uPA浓度显著高于T/T组，此结果与Ertekin-Taner N［14］的研究结果一致。可以认为，plau基因第6外显子上的错义C→T突变可减少血清uPA的浓度，对探讨AD的发病机制提供新思路。

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