四珍力维胶囊抑菌活性与微生物限度检查方法研究

费 嘉，张 儒，贾 阳

四珍力维胶囊是根据首长保障需要，由北京军区总医院制剂中心研制而成。本制剂主要由冬虫夏草、西红花、红景天、西洋参等珍贵中药材及有效部位群组成。经实验研究表明，本品具有活血化瘀、降低血液粘稠度、改善心脑血液循环、提高耐缺氧能力、补益心脑、滋阴壮阳、扶正固本、缓解人体疲劳、增强免疫力、双向调节作用的功能，而且经临床实验证实，本制剂能保护心肌及脑组织、抗冠心病、扩张血管、降低血压，对中枢神经系统有镇静镇痛作用。此外，还有抗炎增智、降脂保肝、滋补强壮、抗疲劳、耐缺氧、抗衰老、免疫调节等作用。本文按照《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法的要求，对其微生物限度检查方法进行探讨。

1 仪器和试药

1.1 仪器 电热恒温干燥箱(上海沪南科学仪器厂)，LRH-250A生化培养箱(广东医疗器械厂)，LRH-250生化培养箱(上海一恒科技有限公司)，XG1-DI型手控小型灭菌器(山东新华医疗机械厂)，UV-1三用紫外灯(上海顾村电光仪器厂)，AEL-200天平(湘仪天平仪器设备有限公司)，WHCD-净化工作台(北京五环空调净化工程公司)，JLQ-S1菌落计数器(无锡县金城仪器厂)。

1.2 试药 四珍力维胶囊(规格:每粒装0.4 g，批号:060909，北京军区总医院药剂科制剂中心提供)。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus.)［CMCC(B)26003］，大肠埃希菌(Escherichia Coli.)［CMCC(B)44102］，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis.)［CMCC(B)63501］，白色念珠菌(Candida albicans.)［CMCC(F)98001］，黑曲霉(Aspergillus niger.)［CMCC(F)98003］，沙门菌(Salmonella.)(北京军区药检所提供)。营养肉汤培养基(批号:050121)，改良马丁培养基(批号:06121)，营养琼脂培养基(批号:050328)，玫瑰红钠琼脂培养基(批号:060216)，曙红亚甲蓝琼脂培养基(批号:0503282)，胆盐乳糖培养基(批号:050224)，MUG培养基(批号:050911)，改良马丁琼脂培养基(批号:070520)，四硫磺酸钠亮绿培养基(批号:060510)，胆盐硫乳琼脂培养基(批号:060303)，pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号:050719)均由北京三药科技开发公司生产。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 分别取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物1 mL加9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至 10-5～10-7，菌数约为 50～100 cfu/mL;取经25℃培养24～48 h的白色念珠菌霉菌改良马丁培养物1 mL加9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-5，菌数约为50～100 cfu/mL;取经25℃培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加3～5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，取比浊后的菌液1 mL加9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至 10-4，菌数约为 50～100 cfu/mL，做计数备用。

2.2 供试液制备 因供试品为贵重药品，检验量由10 g酌减为3 g。取样品3 g，加pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至90 mL，振摇使分散均匀，制成1∶30供试液，做计数备用。另取样品1 g，加pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10 mL，振摇使分散均匀，制成1∶10供试液，做控制菌检查备用。

2.3 计数方法验证

2.3.1 试验组 根据四珍力维胶囊的组方特点以及理化性质，我们采用了常规法和培养基稀释法进行计数方法的验证。取1∶30供试液1.0、0.5和0.2 mL，加入平皿，随后分别加入 50～100 cfu/mL的试验菌，立即倾注不超过45℃的琼脂培养基20 mL，待凝固后，置规定温度培养24～72 h观察结果。

2.3.2 菌液组 取50～100 cfu/mL的试验菌1 mL加入平皿中，立即倾注不超过45℃的琼脂培养基20 mL，待凝固后，置规定温度培养24～72 h观察结果，测定每一菌株的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组 取1∶30供试液1.0、0.5和0.2 mL，加入平皿中，立即倾注不超过45℃的琼脂培养基20 mL，待凝固后，置规定温度培养24～72 h观察结果，测定供试品本底菌数。

2.3.4 稀释剂对照组 取pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1 mL和50～100 cfu/mL的试验菌加入平皿中，立即倾注不超过45℃的琼脂培养基20 mL，待凝固后，置规定温度培养24～72 h观察结果。2.3.5 计数方法验证结果 见表1。

表1 四珍力维胶囊微生物限度计数方法的验证结果

从表1结果可见，四珍力维胶囊细菌计数方法的验证采用培养基稀释法(0.2 mL/皿)，可消除供试品对人工污染枯草芽孢杆菌的抑制作用，回收率均高于70%。

2.4 控制菌检查方法的验证 本品为口服制剂，并且组方中含有动物药以及药材原粉，按照《中国药典》一部的要求，需要对大肠埃希菌、大肠菌群和沙门菌进行检查。

2.4.1 大肠埃希菌 (1)试验组:取1∶10供试液10 mL、10～100 cfu/mL的大肠埃希菌1 mL分别加入100 mL胆盐乳糖培养基中，35℃培养18～24 h。依照大肠埃希菌的检查方法检查。(2)阴性菌对照组:采用金黄色葡萄球菌为阴性对照菌，检查方法同试验组。(3)阳性对照组:取10～100 cfu/mL的大肠埃希菌1 mL加入100 mL胆盐乳糖培养基，依法培养，检查方法同试验组。(4)阴性对照组:取pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液30 mL直接接种于100 mL胆盐乳糖培养基中，检查方法同试验组。

2.4.2 大肠菌群 (1)试验组:取含10 mL的胆盐乳糖发酵培养基1管，加入1∶10的供试液1 mL(含供试品0.1 g)，再加入10～100 cfu大肠埃希菌，混匀，35℃培养18～24 h后观察结果。(2)阴性菌对照组:采用金黄色葡萄球菌为阴性对照菌，检查方法同试验组。(3)阳性对照组:取含10 mL的胆盐乳糖发酵培养基1管，加入10～100 cfu大肠埃希菌，混匀，检查方法同试验组。(4)阴性对照组:取含10 mL的胆盐乳糖发酵培养基1管，加入稀释液作为阴性对照管，混匀，35℃培养18～24 h后观察结果。

2.4.3 沙门菌 (1)试验组:取供试品10 g以及50～100 cfu/mL的沙门菌1 mL直接接种于200 mL的营养肉汤培养基中，搅拌混匀，35℃培养18～24 h后接种于10 mL四硫磺酸钠亮绿培养基中，35℃培养18～24 h后，分别平板划线，35℃培养18～24 h。依照沙门菌的检查方法检查。(2)阴性菌对照组:采用金黄色葡萄球菌为阴性对照菌，检查方法同试验组。(3)阳性对照组:取50～100 cfu/mL的沙门菌1 mL加入到200 mL的营养肉汤培养基中，搅拌混匀，检查方法同试验组。(4)阴性对照组:取200 mL的营养肉汤培养基，检查方法同试验组。

2.4.4 控制菌检查方法验证的结果 见表2。从表2的结果可以看出:四珍力维胶囊控制菌项下的大肠埃希菌、大肠菌群和沙门菌的检查法采用常规方法可正常检出。

表2 四珍力维胶囊控制菌检查方法的验证结果(常规法)

2.5 微生物限度检查方法的建立 根据上述验证结果，四珍力维胶囊细菌计数采用培养基稀释法(0.2 mL/皿)，以枯草芽孢杆菌为阳性对照菌进行检验，霉菌及酵母菌计数采用常规法检验;控制菌检查项下的大肠埃希菌、大肠菌群和沙门菌的检查可采用常规方法，依法检验。

3 讨论

该制剂对枯草芽孢杆菌有较强的抑菌作用，提示该制剂对芽孢杆菌有较强的抑制作用，但是对真菌和革兰阳性菌没有抑制作用。本制剂可采用培养基稀释法消除其抑菌作用，本方法用于微生物限度的检查准确、有效。

［1］药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:化学工业出版社，2010:附录79-88.

［2］中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范［S］.北京:中国医药科技出版社，2005:325-373.

［3］许华玉，杜芸，钱文静，等.药品微生物限度检查法中细菌和真菌计数方法的验证试验［J］.中国中药杂志，2005，30(24):1918-1920.

［4］周修森，李道明.甲硝唑诺氟沙星栓微生物限度检查方法研究［J］.中国医药导报，2010，7(4):42-44.

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