胃痛消痞方对肝郁脾虚型功能性消化不良大鼠血清及胃窦组织中NT、SP含量的影响

吴艳慧，于文靖，陈苏宁

功能性消化不良(FD)是一组无胃肠道器质性病变，以持续性腹痛、腹胀、早饱、恶心呕吐、嗳气、反酸、烧心、食道异物感等为表现的临床症候群，其发生与胃肠动力障碍密切相关。胃肠激素是影响胃肠动力的重要因素，神经降压素(Neurotensin)对其具有抑制作用，P物质(P-substance)是胃肠运动重要的兴奋性神经递质。祖国医学将FD归属于“胃脘痛”和“痞满”等范畴，其主要病机是肝郁气滞、脾胃虚寒。本实验通过观察胃痛消痞方对肝郁脾虚型FD大鼠血清及胃窦中NT、SP含量的影响，探讨肝郁脾虚型FD的发病机制，旨在指导其临床治疗。

1 实验材料

1.1 动物 健康SPF级Wistar雄性大鼠40只，12周龄，体质量为250～280 g。

1.2 药物 胃痛消痞方由柴胡、白芍、延胡索、枳实、砂仁、炒麦芽、焦山楂、炒鸡内金、党参、炒白术、炙甘草组成，由深圳华润三九医药集团提供免煎颗粒，用蒸馏水稀释成浓度为0.5 g/mL的溶液，4℃冰箱保存;西沙必利片为上海沪源医药有限公司产品，给药前用蒸馏水稀释成0.02 g/mL的溶液。

1.3 试剂 NT、SP酶联免疫吸附测定(Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒由美国RD公司提供;NT、SP抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供，SP免疫组化染色试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.4 仪器 ELx808吸收光酶标仪、D-37520 Heraeus高速冷冻离心机、DH4000A电热恒温培养箱、TB-718D生物组织自动包埋机、Mettler-Tole-DO AL104型电子天平、TK-218型恒温摊片烤片机、ZT-12M 生物组织自动脱水机、Microm HM340E半自动轮转切片机、NIKON E800光学显微镜。

2 实验方法

2.1 造模及给药 将大鼠采用随机数字表方法随机分为4组，即胃痛消痞方(中药)组、西沙必利(西药)组、模型组、正常对照组，每组10只。除正常对照组外，其余3组均采用改良夹尾刺激法［1］制造FD肝郁脾虚模型，每次夹尾刺激持续30 min，2次/d，连续刺激21d。造模成功后，将胃痛消痞方、西沙必利依据人和鼠给药剂量换算公式［2］dB=dARB/RA(WA/WB)1/3 进行计算，中药组给予胃痛消痞方9 g/kg，1次/d，西药组给予西沙必利2 mg/kg，模型组及正常对照组给予灌服等量蒸馏水，1次/d灌胃，持续21d。

2.2 实验步骤

2.2.1 ELISA法检测血清中NT含量 分别设空白孔、标准品孔、待测样本孔，记录各孔位置。在标准品孔中加标准品50 μL，待测样品孔加入各组血清40 μL，然后各加入抗-NT 抗体10 μL、链霉素亲和素-HRP50 μL，空白对照孔不加，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置30 s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次。每孔先加入显色剂A液50 μL，再加入显色剂B液50 μL，用手轻轻震荡混匀30 s，37℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的OD值。测定应在加终止液后15 min内进行，根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

2.2.2 按“2.2.1”项方法检测血清中SP含量。

2.2.3 免疫组化法测定胃窦组织中NT、SP含量标本固定后进行梯度脱水，石蜡包埋，切片厚度为5 μm，常规脱蜡至水。用3%H2O2室温孵育10 min以灭活内源性酶，PBS洗3次。将切片浸入0.01 mol柠檬酸钠缓冲液(pH值6.0)，电炉加热至沸腾后断电，5 min后取出置室温冷却。冷却后PBS洗涤3次，3 min/次。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩出多余液体。滴加适当稀释的一抗(分别为兔抗大鼠NT抗体和兔抗大鼠SP抗体)，4℃ 冰箱过夜。取出后PBS洗3次，3 min/次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温孵育20 min，PBS洗3次，3 min/次。滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育20 min，PBS洗3次，3 min/次。取1 mL蒸馏水，加DAB显色试剂盒A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间30 s。苏木素轻度复染1 min，脱水，透明，封片，晾干，用光学显微镜(10×40倍)观察胃肠组织中NT、SP阳性产物的分布。用HUMIAS-2000医学图文分析系统，通过显微摄像系统放大400倍，每张切片随机选取5个无重叠视野，测定胃窦及十二指肠组织中NT、SP阳性纤维的平均灰度值，以此分别代表NT、SP的含量。

2.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 模型组血清、胃组织中NT含量明显升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明造模成功。经治疗后，中药组、西药组NT含量均明显降低，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);中药组和西药组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 大鼠血清、胃组织中NT含量(mg/L)

3.2 模型组血清、胃组织中SP含量明显降低，与正常组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明造模成功。经治疗后，中药组、西药组SP含量明显升高，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);中药组和西药组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 大鼠血清、胃组织中SP含量(mg/L)

3.3 每张切片于400倍光镜下随机选取5个视野，分别观察其阳性产物的分布、染色情况，光镜下，大鼠胃组织中NT、SP染色部位在胞浆，胞大而核圆，棕色或深黄色为强阳性，黄色为阳性，淡黄色为弱阳性。见图1。

图1 四组光镜下NT、SP的分布及染色情况

4 讨论

胃痛消痞方由柴胡、白芍、延胡索、炒枳实、砂仁、炒麦芽、焦山楂、炒鸡内金、党参、炒白术、炙甘草组成。柴胡可疏肝行气解郁，配伍陈皮理气降逆，共为君药;厚朴、炒枳实、山楂、神曲、炒麦芽、炒白术、砂仁可燥湿除满、理气和中、消食，共为臣药;白芍功善养血柔肝、补阴抑阳，为佐药;甘草调和全方。诸药共奏疏肝理气、和胃健脾之功，使肝疏泄条达、脾升胃降得复，紊乱的消化功能得以恢复。本实验采用夹尾法使大鼠激怒，进而肝气不舒，肝郁犯脾，脾失健运，从而建立了肝郁脾虚型FD大鼠模型，治法当以疏肝健脾为主。

1975年Carraway等确定NT为13个氨基酸组成的直链多肽，由开放型的N细胞分泌，而约85%的N细胞存在于胃肠道。既往已有较多研究表明，NT 可抑制胃肠道运动，延缓胃排空［3-5］。Nightingale等［6］发现，回肠切除术后的患者，由于N细胞减少，血浆NT水平降低，从而导致液体在胃中排空加速。SP主要存在于中枢神经系统和肠道神经系统，小部分分布于肠嗜铬细胞，是肠道感觉神经系统的重要组成部分，与痛觉传导有关，可能参与各种内脏神经反射，能促进肠道平滑肌收缩和肠蠕动，促进胃排空［7-8］，并且能刺激胆囊收缩。也有研究证明，SP是胃肠运动调节中主要的兴奋性神经递质，存在于肠肌神经丛内的SP神经细胞体发出神经纤维到肠壁各层，可能参与各种内脏神经反射，并通过特异的神经通路来促进胃肠道平滑肌收缩和肠蠕动，调节胃肠动力和排空功能［9］。

本研究结果显示，模型组血清NT含量与正常对照组相比明显升高，SP含量降低，模型组大鼠较正常组相比胃窦及十二指肠部NT阳性免疫产物增多，SP阳性免疫产物明显减少，说明NT升高、SP降低均可能是引起FD的原因。治疗后，中药组、西药组NT含量均明显降低，SP含量明显升高，亦证实了上述观点，从而进一步验证了神经降压素及P物质是FD发病的神经生物学基础。

综上所述，本实验结果为中药胃痛消痞方的临床应用及今后进一步研究提供了重要依据。

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