羊毛脂微生物转化法制备胆固醇

马志军，薛家禄，南清卫，陈朝武，刘向阳，李建勋，别松涛

（1.河南利伟生物药业股份有限公司，河南 焦作454850；2.天津科技大学 工业微生物教育部重点实验室，天津300457）

胆固醇，也称胆甾醇，是一种天然的甾体资源，是合成维生素D3的主要原材料，广泛应用于化妆品、医药等领域[1］。美国CTFA（化妆品香料香精协会）化妆品原料手册已将胆固醇列为可加入化妆品的天然活性物质。

胆固醇在羊毛脂中含量很高，而我国羊毛脂资源丰富，因此，研究从羊毛脂中提取胆固醇意义重大。目前，从羊毛脂中提取胆固醇主要采用色谱法、溴化法、分子蒸馏法、超临界萃取法、溶剂选择结晶法和配合法等化学方法[2］，均用到了有机溶剂，不符合生态环保的科学理念[3］。

作者以羊毛脂为底物筛选菌株，利用筛选到的菌株对羊毛脂进行微生物转化制备胆固醇，并对发酵条件进行了优化。

1 实验

1.1 土壤样品与培养基

土壤样品采集自洗毛废弃物倾倒处和胆固醇生产工厂。

PDA平板培养基：马铃薯汁1000mL，葡萄糖20g，琼脂20g，羊毛脂30g，121℃高压灭菌20min。

发酵培养基：麦芽糖90g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL，pH值7.6。

1.2 材料、试剂与仪器

羊毛脂，江阴星鹏化工有限公司。

三氯甲烷，东营富隆化工有限公司；硫酸，江苏索普有限公司；标准胆固醇（色谱级），美国Sigma公司；乙腈、异丙醇、95%乙醇、无水乙醇、正己烷、乙醚、石油醚（30～600℃），市售。

N2000色谱工作站：杭州亿捷科技有限公司。色谱条件：LC－10ATVP PLUS Wondersil C18色谱柱；流动相为乙腈－异丙醇（4∶1，体积比）；柱温40℃；流速0.6mL·min－1；检测波长210nm；进样量10μL。

1.3 方法

1.3.1 菌株的筛选与鉴定

取土壤样品1.0g，置于已消毒的试管中，加入无菌水10mL后以涡旋振荡器振荡摇匀，静置，取上层清液，滴于PDA平板培养基上，以玻璃棒涂匀，置于27℃恒温培养箱中培养2～5d，待平板上长出菌落后，挑出单菌落于准备好的PDA平板培养基上，根据形态特征判断纯的菌株，编号保存。

将分离得到的菌株分别接种在发酵培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1.0g置于试管中，加入三氯甲烷10mL并振荡，使培养基中可能存在的胆固醇充分溶解，再加入10%浓硫酸10mL。观察三氯甲烷层若呈血红色，则推测此菌株具备转化能力；若不呈血红色，则不具备转化能力[4］。将获得的具有转化能力的菌株编号N0012。

将菌株N0012在分离培养基上培养，并用显微镜进行鉴定。

1.3.2 羊毛脂微生物转化制备胆固醇

以筛选获得的菌株N0012进行半固体平板培养较长时间，取菌落下的培养基0.5g于具塞试管中，加入5mL 95%乙醇，充分振荡；然后加入10mL乙醚，振荡；再加入10mL石油醚，充分振荡后静置使液层分离。取上层有机相1.0mL用氮气吹干，并以0.5mL无水乙醇溶解进行HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 菌株的鉴定

实验发现，筛选获得的菌株在分离培养基上培养，菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状、坚实、干燥、多皱，可初步判断菌株为放线菌。在显微镜下观察，细菌呈分枝丝状，可进一步确定菌株为放线菌[5］。

2.2 HPLC分析（图1）

图1 胆固醇标准品（a）和羊毛脂转化产物（b）的HPLC图谱Fig.1 The HPLC chromatograms of cholesterol standard（a）and the transformation product of wool grease（b）

由图1可知，羊毛脂转化产物与胆固醇标准品的出峰时间基本相同，表明通过微生物转化获得了胆固醇。

2.3 发酵条件的优化

2.3.1 发酵pH 值（图2）

图2 发酵pH值对胆固醇产量的影响Fig.2 The effect of fermentation pH value on cholesterol production

由图2可知，发酵pH值为7.6时，胆固醇产量最高。故选择适宜的发酵pH值为7.6。

2.3.2 发酵温度（图3）

由图3可知，发酵温度为30℃时，胆固醇产量最高。故选择适宜的发酵温度为30℃

。2.3.3 发酵时间（图4）

由图4可知，发酵110h时的胆固醇产量最高。故选择适宜的发酵时间为110h。

2.3.4 碳源

碳源添加量为10g·L－1、固定其它条件，考察葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、乳糖、可溶性淀粉等不同碳源对胆固醇产量的影响，结果见图5。

图5 不同碳源对胆固醇产量的影响Fig.5 The effect of different carbon sources oncholesterol production

由图5可知，以麦芽糖为碳源时，胆固醇产量最高。故选择最适碳源为麦芽糖。

麦芽糖浓度对胆固醇产量的影响见图6。

图6 麦芽糖浓度对胆固醇产量的影响Fig.6 The effect of maltose concentration on cholesterol production

由图6可知，麦芽糖浓度为90g·L－1时，胆固醇产量最高。故选择适宜的麦芽糖浓度为90g·L－1。

2.3.5 羊毛脂浓度（图7）

图7 羊毛脂浓度对胆固醇产量的影响Fig.7 The effect of wool grease concentration on cholesterol production

由图7可知，羊毛脂浓度为80g·L－1时，胆固醇产量最高。故选择适宜的羊毛脂浓度为80g·L－1。

3 结论

（1）从土壤中筛选到一株可将羊毛脂转化为胆固醇的菌株，经形态学分析确定其为放线菌。

（2）以羊毛脂为底物微生物转化制备胆固醇，其最佳发酵条件如下：发酵pH值7.6、发酵温度30℃、发酵时间110h、碳源麦芽糖浓度90g·L－1、羊毛脂浓度80g·L－1，在此条件下，胆固醇产量达到516mg·mL－1。

[1]Lower E S.Cholesterol in cosmetic formulation—A review [J］.Drug ＆ Cosmetic Industry，1975，116（5）：54－57.

[2]胡芬，谭兰兰，杨景昌，等.从羊毛醇中提取胆甾醇的工艺研究[J］.化学研究与应用，2008，20（11）：1441－1446.

[3]Truter E V.The extraction of cholesterol from wool wax alcohol[J］.Manufacturing Chemist，1955，26（3）：231－235.

[4]国家药典委员会.中国药典[M］.北京：中国医药科技出版社，2010：57－58.

[5]阮继生，黄英.放线菌快速鉴定与系统分类[M］.北京：科学出版社，2011：254－258.