罗非鱼鱼鳞粉直接酶解制备胶原蛋白的工艺研究

孙宪迅，孙齐英，韩 雪，周理红

（江汉大学生命科学学院，湖北 武汉430056）

胶原蛋白在食品、医药、美容等领域的应用越来越广泛，年增长率达到15%[1～5］。传统的胶原蛋白制备方法是以猪、牛等陆生动物的皮和骨头为原料进行提取的。近年由于疯牛病和口蹄疫等疾病的发生，使胶原蛋白的原料安全性受到质疑。

罗非鱼耐低氧，易养殖，在海水、淡水中均可养殖，已被视为传统鱼类的替代品种，是世界性的主要养殖鱼类[6，7］。我国养殖罗非鱼产量占世界总产量的50%以上，加工产生的罗非鱼鱼鳞逐年增加[8］。鱼鳞中含有50%～70%的蛋白质，主要为胶原蛋白和角蛋白。从鱼鳞中提取胶原蛋白[6，9～14］，一般是在酶解前用酸、碱浸泡鱼鳞以溶解无机盐，这样不可避免地产生了一定量的废水，还造成部分蛋白质损失[15～18］。

作者在此将罗非鱼鱼鳞用气流式超微粉高速粉碎机粉碎后过筛，直接用碱性蛋白酶（Alcalase）酶解，酶解液经浓缩、干燥，得到胶原蛋白粉。以胶原蛋白提取率为考核指标，通过单因素实验和正交实验对酶解条件进行了优化。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

罗非鱼鱼鳞，购自海南水产品市场。

碱性蛋白酶（2.4AU·g－1），诺维信（中国）公司。

RT－25小型气流式超微粉高速粉碎机，紫外分光光度计，ZFQ 85－A 型旋转蒸发仪，LGL 05－2型真空冷冻干燥机。

1.2 工艺流程

罗非鱼鱼鳞→干燥→粉碎→过筛→Alcalase酶解→灭酶→过滤→取上清液→冷冻干燥→胶原蛋白粉

1.3 罗非鱼鱼鳞粉碎度对胶原蛋白提取的影响

称取50g罗非鱼鱼鳞，用气流式超微粉高速粉碎机粉碎后，分别用400目、300目、200目、160目、120目、100目、80目、60目的筛子过筛分级，各取1g罗非鱼鳞粉，使鱼鳞粉的质量分数为7%，测定鱼鳞粉碎度对胶原蛋白提取的影响。

1.4 单因素实验

取粉碎度≥100目的鱼鳞粉，分别考察罗非鱼鱼鳞粉质量分数（3%、5%、7%、9%、11%、13%）、酶解温度（50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）、酶解pH 值（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）、酶加量（0.02AU·g－1、0.04AU·g－1、0.06AU·g－1、0.08AU·g－1、0.10 AU·g－1）、酶解时间（0.5h、1.0h、2.0h、3.0h）对胶原蛋白提取率的影响。除所研究因素外，其它各因素取基本值（酶解温度60℃ ，酶解pH值9.0，罗非鱼鱼鳞粉质量分数7%，酶加量0.04AU·g－1，酶解时间2.0h）。

1.5 正交实验

参照文献[10，12，16］，选择酶解温度、酶解 pH 值、酶加量、酶解时间为考察因素，以胶原蛋白提取率为考核指标，进行L9（34）正交实验，以优化酶解条件。正交实验的因素与水平见表1 。

表1 正交实验的因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.6 胶原蛋白提取率的测定

用凯氏定氮法分别测定胶原蛋白粉和原料中的氮含量，按下式计算胶原蛋白提取率。

2 结果与讨论

2.1 鱼鳞粉碎度对胶原蛋白提取率的影响（图1）

图1 鱼鳞粉碎度对胶原蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of mesh of tilapia scale powder on extraction rate of collagen

由图1可知，胶原蛋白提取率随鱼鳞粉目数的增大而升高。在60～100目，胶原蛋白提取率迅速升高；在100～400目，胶原蛋白提取率缓慢升高。这是因为，鱼鳞粉碎后，破坏了鱼鳞中胶原蛋白的主要保护组织羟基磷灰石的晶体结构，使胶原蛋白能与酶接触，充分酶解，当粉碎度较大时，鱼鳞粉颗粒越小，比表面积越大，酶吸附在鱼鳞粉末的机会越多，反应越彻底，胶原蛋白提取率越高；当粉碎度较小时，鱼鳞粉颗粒越大，酶与鱼鳞接触的面积越小，颗粒内部的胶原蛋白不易与酶接触，造成酶解效率低。考虑到加工成本，选用鱼鳞粉碎度为100目。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 罗非鱼鱼鳞粉质量分数对胶原蛋白提取率的影响（图2）

由图2可知，胶原蛋白提取率随罗非鱼鱼鳞粉质量分数的增加而降低，当罗非鱼鱼鳞粉质量分数从3%增加到7%时，胶原蛋白提取率缓慢降低；当罗非鱼鱼鳞粉质量分数从7%增加到9%时，胶原蛋白提取率迅速降低；之后，降幅趋缓。这是因为，增加罗非鱼鱼鳞粉质量分数，酶解液粘度增大，影响酶与罗非鱼鱼鳞粉结合，酶解效果差，提取率下降；罗非鱼鱼鳞粉质量分数较小时，酶解效果较好，胶原蛋白提取率较高。考虑到下游的过滤与干燥成本，选择罗非鱼鱼鳞粉质量分数为7%。

图2 罗非鱼鱼鳞粉质量分数对胶原蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of mass fraction of tilapia scale powder on extraction rate of collagen

2.2.2 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响（图3）

图3 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of collagen

由图3可知，胶原蛋白提取率随酶解温度的升高先升高后降低，在酶解温度为60℃时达到最高。这是因为，高温使维持酶分子结构的次级键解体，导致酶蛋白变性，从而使得酶活性减弱或丧失。因此，选择酶解温度为60℃。

2.2.3 酶解pH值对胶原蛋白提取率的影响（图4）

由图4可知，胶原蛋白提取率随酶解pH值的增大先升高后降低，在酶解pH值为9.0时达到最高。因此，选择酶解pH值为9.0。

2.2.4 酶加量对胶原蛋白提取率的影响（图5）

由图5可知，胶原蛋白提取率随酶加量的增大先升高后降低，在酶加量为0.06AU·g－1时，胶原蛋白提取率较高，但与酶加量为0.04AU·g－1相比升幅很小。因此，选择酶加量为0.04AU·g－1。

2.2.5 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响（图6）

图6 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.6 Effect of enzymolysis time on extraction rate of collagen

由图6可知，酶解0.5～2.0h内，胶原蛋白提取率迅度升高；之后，随着酶解时间的延长，胶原蛋白提取率升幅不明显。这是因为，2.0h以后，提取液中蛋白质浓度高，粘性大，阻止了酶与底物的进一步接触和胶原蛋白的溶出，即使继续延长酶解时间，上清液中的胶原蛋白含量也不会明显升高。综合考虑，选择酶解时间为2.0h。

2.3 正交实验结果与分析（表2 ）

表2 正交实验结果与分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2 可知，各因素对胶原蛋白提取率的影响大小依次为A＞D＞C＞B，即酶解温度＞酶解时间＞酶加量＞酶解pH值。碱性蛋白酶酶解罗非鱼鱼鳞制备胶原蛋白的最优水平组合为A3B1C3D2，即最佳酶解条件为：酶解温度65℃、酶解pH值8.5、酶加量0.05 AU·g－1、酶解时间2.0h。

在上述最佳酶解条件下进行验证实验，胶原蛋白提取率达95.79%。

3 结论

采用碱性蛋白酶直接酶解罗非鱼鱼鳞制备胶原蛋白，通过单因素实验和正交实验，确定最佳酶解条件为：100目罗非鱼鱼鳞粉质量分数7%、酶解温度65℃、酶解pH值8.5、酶加量0.05AU·g－1、酶解时间2.0h，在此条件下，胶原蛋白提取率达95.79%。该方法具有产率高、环境友好等优点，适于工业化大规模生产。

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