肠炎沙门菌LAMP 检测方法的建立

邓显文，谢芝勋，谢丽基，谢志勤，刘加波，庞耀珊，彭 宜，范 晴

（广西兽医研究所，广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001）

肠炎沙门菌是目前引起人类食物中毒的主要病原之一，其感染主要是因食用了被肠炎沙门菌污染的动物性食品，尤其是家禽的肉蛋食品，近年来，肠炎沙门菌食物中毒和动物感染肠炎沙门菌十分严重，已引起养殖业和公共卫生界的高度重视［1－4］。目前应用PCR技术对SE的检测已有报道［5－9］，PCR检测方法虽然快速、敏感性较高，但是需要使用昂贵的仪器和试剂等，环介导等温扩增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型核酸扩增技术，该技术具有简捷、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛应用［10－11］。本试验用SE种特异的 DNA 序列（Salmonella difference fragment，SdfⅠ）构建LAMP方法检测肠炎沙门菌，为临床检测肠炎沙门菌的感染调查奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所使用的肠炎沙门菌（SE28、SE29、SE30、SE75、SE90、SE221、SE635）、伤寒沙门菌（S.typhi）、副伤寒沙门菌（S.parutyphi）、鸡沙门菌（S.pullerium）由美国康州大学Khan教授惠赠，鸡沙门菌（CVCC533）、马流产沙门菌（CVCC514）、肠炎沙门菌（CVCC2182、CVCC2183、CVCC2184）、猪霍乱沙门菌（CVCC2179）、伤寒沙门菌（CVCC2213）、雷丁沙门菌（CVCC2210）、甲型副伤寒沙门菌（CVCC2189）、鼠伤寒沙门菌（CVCC2233）、肠炎沙门氏菌亚种（CVCC3374、CVCC3375、CVCC3376、CVCC3377、CVCC3378）由中国国家兽医微生物菌种保藏管理中心购买，大肠埃希菌、葡萄球菌、嗜水气单胞菌、链球菌、爱德华菌、鸡毒支原体、副鸡嗜血杆菌均广西畜禽疫苗新技术重点实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参照Gen Bank中SE种特异的DNA 序 列 （Salmonella difference fragment ，SdfⅠ），利用Primer Exporer V4在线设计软件，设计LAMP引物，其中包括2条外引物SDF3／SDB3和2条内引物SDFIP／SDBIP，以及2条用于提高扩增效率的环引物SDBloop和SDFloop，在SDF1c、SDF2和SDB1c、SDB2之间分别添加Eco RⅠ酶切位点。引物由上海Invitrogen公司合成（表1）。

1.2.2 SE DNA的提取和模板的制备 DNA抽提：将菌株分别接种于LB培养基，37℃培养24 h至变混浊时，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2次后，用适当TE缓冲液悬浮沉淀，参照TIANgen DNA提取试剂盒说明书，其他对照菌（毒）株的DNA的抽提方法相同。

SE DNA模板的制备：用SDB3、SDF3引物PCR扩增SE28 DNA，用凝胶回收试剂盒纯化回收的PCR扩增产物，将PCR产物连入pGM－18 T载体，用PCR快速鉴定，阳性重组菌送宝生物工程（大连）有限公司进行测序，在GenBank中对序列进行BLAST分析，验证扩增产物的特异性。提取阳性重组菌质粒，通过D260测定DNA浓度，置－70℃保存备用。

表1 扩增SE的LAMP引物序列Table1 LAMP primers for amplifying SE

1.2.3 LAMP方法的优化 反应体系的建立：肠炎沙门菌LAMP的反应体系为25μL，各组份的终浓度为SDF3和SDB3各0.2μmol／L、SDFIP和SDBIP各1.6μmol／L、SDFLoop和 SDBLoop各0.8μmol／L、10×bst polymerase buffer 2.5μL、d NTP 1.4 mmol／L、betaine 1 mmol／L、MgSO440 mmol／L、MnCl240 mmol／L、钙黄绿素40 mmol／L、Bst DNA聚合酶8 U、模板1μL。

将温度按58、60、62、64、65、67℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。对反应体系在如下范围内进行优化：Betaine（0.06 mol／L～0.2 mol／L）、MgSO4（1 mmol／L～6 mmol／L）、d NTP（0.4 mmol／L～1.6 mmol／L）

每次检测时，设置阴性对照（健康组织的基因组DNA）；在阴性对照和阳性对照均成立时，整个试验有效，可判定结果。

1.2.4 特异性试验 按照所建立的肠炎沙门菌LAMP 方 法，同 时 对 SE28、SE29、SE30、SE75、SE90、SE221、SE635、S.typhi、S.Parutyphi、S.Pullerium， CVCC533、 CVCC514、 CVCC2182、CVCC2183、CVCC2184、CVCC2197、CVCC2213、CVCC2210、CVCC2189、CVCC2233、CVCC3374、CVCC3375、CVCC3376、CVCC3377、CVCC3378，Eco.l、葡萄球菌、嗜水气单胞菌、链球菌、爱德华菌、鸡毒支原体、副鸡嗜血杆菌等DNA进行LAMP检测，验证LAMP方法的特异性。取2μL LAMP反应产物于20 g／L琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

1.2.5 敏感性试验 将SE28 DNA按10倍倍比稀释至100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg和1 fg，用优化好的LAMP方法和常规PCR方法同时检测，进而对两者的敏感性进行比较。

1.2.6 重复性试验 提取等量6份不同的SE28株培养物的DNA，进行LAMP检测，在同一反应条件下进行3次重复性试验。

1.2.7 临床样品检测 对采集的10份病料样品进行分离鉴定，并提取病料DAN进行LAMP检测。

2 结果

2.1 LAMP反应条件优化结果

2.1.1 反应温度的优化 通过对反应温度的优化，最终确定该LAMP检测方法的最佳反应温度为63℃～65℃，加环引物反应时间为50 min，未加环引物反应时间为2.5 h。

2.1.2 LAMP反应体系的优化 通过对各反应条件的优化，最终确定LAMP反应体系为25μL：Bst DNA聚合酶8 U、10×Bst buffer 2.5μL、d NTPs（10 mmol／L）3.5μL、Betaine（1 mol／L）5.0μL、MgSO4（25 mmol／L）4μL、FIP／BIP（20μmol／L）2 μL、B3／F3（20 μmol／L）0.25 μL、LF／LB（20 μmol／L）1μL、Calcein（625μmol／L）1μL、MnCl2（12.5 mmol／L）1μL、模板 DNA 1μL，加水至25 μL。充分混匀后，在水浴锅中64℃反应1 h，80℃作用10 min灭活。

2.2 特异性试验结果

用建立的LAMP方法进行检测，只有肠炎沙门菌（SE28、SE29、SE30、SE75、SE90、SE221、SE635），肠炎沙门菌（CVCC2182、CVCC2183、CVCC2184）、肠 炎 沙 门 菌 亚 种 （CVCC3374、CVCC3375、CVCC3376、CVCC3377、CVCC3378）等15株肠炎沙门菌的DNA为阳性结果（肉眼观察可见翠绿色，琼脂糖凝胶电泳呈现特征性梯形条带），而对伤寒沙门菌（S.typhi）、副伤寒沙门菌（S.parutyphi）、鸡沙门菌（S.pullerium）、鸡沙门菌（CVCC533）、马流产沙门菌（CVCC514）、猪霍乱沙门菌（CVCC2179）、伤寒沙门菌（CVCC2213）、雷丁沙门菌（CVCC2210）、甲型副伤寒沙门菌（CVCC2189）、鼠伤寒沙门菌（CVCC2233）等10株其他沙门菌和其他细菌7株（大肠埃希菌、葡萄球菌、嗜水气单胞菌、链球菌、爱德华菌、鸡毒支原体、副鸡嗜血杆菌）的DNA检测均为阴性（肉眼观察可见桔红色，均没有特征性梯形条带出现）。图1中只有部分菌株，其余菌株图略。

2.3 敏感性试验结果

所建立的LAMP对SE28 DNA的最小检测限为100 fg（图2），肉眼观察可见翠绿色，琼脂糖凝胶电泳呈现特征性梯形条带，而常规PCR方法最小检测限为10 pg（图3），建立的LAMP敏感性比常规PCR高100倍。

2.4 临床样品检测

对10份病料样品抽提DNA后直接进行LAMP检测，结果有3份为阳性（图4，肉眼观察可见翠绿色，琼脂糖凝胶电泳呈现特征性梯形条带），与PCR及测序鉴定的结果一致。

3 讨论

LAMP是一新型的核酸扩增技术，该技术克服了传统PCR技术的一些缺点，LAMP技术是一种简便、快速、灵敏、成本低廉的新型核酸扩增技术，该技术在等温条件下即可进行核酸的变性和扩增，不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成扩增反应［12］，并且反应结果无需经过电泳就可以直接观察，肉眼可见阳性样品的反应液变成翠绿色，阴性样品的反应液则为桔红色，因此应用前景广阔。

目前，国内外均未见有建立SE LAMP可视化检测方法的相关报道，本研究在SE种特异的DNA序列（Salmonella difference fragment，SdfⅠ）的保守序列设计了针对8个特异区域的6条引物，使扩增反应具有很高的特异性，在内引物之间增加两条环引物提高了扩增效率，缩短了LAMP的反应时间。通过优化反应条件后，建立了SE的LAMP检测方法。所建立的SE LAMP检测方法只在水浴锅中1 h即可完成能特异的检测SE，对SE28等15株肠炎沙门菌的DNA检测为阳性结果（肉眼观察可见翠绿色），而对CVCC2210等10株其他沙门菌和大肠埃希菌等7株其他细菌的DNA检测均为阴性（肉眼观察可见桔红色），并且检测的灵敏度非常高，能检测到100 fg的SE DNA样品，灵敏度是常规PCR的100倍，所建立的LAMP方法检测肠炎沙门菌，为临床检测肠炎沙门菌的感染调查奠定基础。

LAMP反应具有较高的灵敏度，易受到反应试剂、反应器材及环境中污染的微量DNA模板而导致假阳性结果的出现，因此配制LAMP反应体系时，应将配制反应体系的区域、加样区域与观察反应结果的区域进行严格分区，防止假阳性结果的出现。常规的LAMP方法，需要在反应结束后加入SYBR Green或Gene Finder染料显色，反应产物易形成气溶胶污染环境而造成假阳性，同时SYBR Green或Gene Finder染料还会因为引物二聚体而引起假阳性。因此，本研究使用Calcein＋MnCl2替代了SYBR Green和 Gene Finder，在配制 LAMP反应液时就可以加入反应液中，并且Calcein＋MnCl2仅在发生LAMP反应时才呈现翠绿色，避免了SYBR Green和Gene Finder染料造成的假阳性问题，具有更好的特异性。

建立的SE LAMP检测方法具有快速、灵敏、特异、简便的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅，并且结果可以无需仪器而仅通过肉眼判定，适合在边境口岸、食品厂、基层兽医站和养殖场中进行快速检测，因此用LAMP快速检测SE，对SE的有效防控有重要意义，具有较好的应用前景。

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