丁型肝炎病毒ORF5基因片段的原核表达及在ELISA 中的初步应用

王云龙，王 娟，李玉林，董彩文，孙新城，张怡青，王国强，李恒思，刘旺根

（1.河南师范大学，河南新乡453007；2.郑州职业技术学院，河南郑州450001；3.河南省生物工程技术研究中心，河南郑州450001）

丁型肝炎病毒（Hepatitis delta virus，HDV）感染呈全球分布，尤其是与乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）共感染或联合感染，会迅速暴发并可能发展成肝癌或肝硬化［1］。目前，对于丁型肝炎的治疗还没特效药物和有效的治疗手段［2］，早期诊断和预防是防止病毒感染的主要措施。早期诊断主要是检测血清中Ig M抗体，获得特异性抗原是建立检测方法的主要难题。

丁型肝炎病毒基因组全长1.7 kb，含有多个开放阅读框，其中一个开放阅读框（ORF5）表达蛋白与HDAg功能性有关［3－4］。目前 HDAg在原核、真核细胞和昆虫病毒中均有表达［5－7］。本研究扩增 HDAg表达基因，构建原核表达载体，经诱导表达和纯化，获得了纯度较高的蛋白，可为建立丁型肝炎早期检测试剂盒提供材料来源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和宿主菌 p ETHD质粒由中国疾病预防控制中心惠赠，含有ORF5编码区基因。表达载体PET－30a购自Novagen公司，克隆菌TG1，表达宿主菌BL21（DE3）本实验室保存。

1.1.2 引物设计 根据表达质粒和HDAg编码区设计 引 物，上游引物5′－CGCGGATCCCAT AT－GAGCCGCTCCGAATCGAGGAAACAT－3′ （含Bam H Ⅰ 酶 切 位 点 ）， 下游引物 5′－CCCAAGCTTGCTAGCCCCGGGCGCTCCCCTCGAT－3′（Hin dⅢ酶切位点），由上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。

1.1.3 主要试剂 Bam HⅠ、Hin dⅢ限制性内切酶、T4 DNA ligase购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA胶回收试剂盒购自Axygen；异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）购自Sigma公司；丁型肝炎病毒（HDV）阳性血清、阴性血清，人免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒 （HAV）、甲型肝 炎病毒（HCV）、成型肝炎病毒（HEV）阳性血清，抗人Ig M（μ链）单克隆抗体，由河南省生物工程技术研究中心提供；其他试剂均为国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建 建立30μL PCR反应体系（20×buffer，1.5μL；MgCl2，0.6μL；d NTP，0.3μL；上游引物，0.2μL；下游引物，0.2μL；DNA 聚合酶，0.3μL；p ETHD，0.5μL ；dd H2O，26.4μL），反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，36个循环；72℃5 min。得到HDAg基因片段，预期扩增片段500 bp，用限制性内切酶Bam HⅠ、Hin dⅢ分别酶切PCR产物和质粒pET－30a，15 g／L琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，用DNA胶回收试剂盒回收目的条带和载体片段。T4连接酶16℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞大肠埃希菌TG1中，涂LB平板（含Kana 30 mg／L），37℃过夜培养，挑取 LB平板上单个菌落做菌落PCR。挑取菌落PCR阳性的菌落培养18 h后提取质粒，Bam HⅠ、Hin dⅢ双酶切鉴定。酶切正确的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.2 HDAg的小量原核表达条件优化 将测序正确的阳性质粒转入宿主细胞BL21（DE3）中，涂LB平板（含Kana 30 mg／L）。从平板上挑取单菌落，接种于3.5 mL LB液体培养基中（含 Kana 30 mg／L），37℃摇床培养12 h。取菌液100μL转接3.5 mL LB培养基中（含Kana 30 mg／L）。当培养至 OD600 nm约为0.3～0.5，分别加入IPTG至其终浓度为0.05、0.1、0.2 mmol／L，另取一支不加IPTG，作为对照，37℃振荡培养4 h，随后取1.0 mL菌液以1 200 r／min破碎离心2 min，离心后取上清和沉淀加上样缓冲液进行SDS－PAGE，确定最佳IPTG诱导浓度。在3.5 mL培养基中加入IPTG至最佳诱导浓度，于37℃振荡培养，取不同时间段（诱导表达2、4、6、8 h）的表达产物各1.0 mL以1 200 r／min破碎离心2 min，离心后取上清和沉淀加上样缓冲液进行SDS－PAGE。最后在最佳诱导浓度和最佳诱导时间确定后，分别于25、30、37℃不同温度诱导，表达产物各1.0 mL以1 200 r／min破碎离心2 min，离心后取上清和沉淀加上样缓冲液进行SDS－PAGE。

1.2.3 HDAg的大量诱导表达 按照优化最佳诱导条件，取稳定表达的菌液500μL接于500 mL LB液体培养基（含 Kana 30 mg／L），进行大样诱导表达，收集菌液，8 000 r／min离心10 min，弃培养液，加入0.05 mmol／L PB洗涤沉淀，8000 r／min离心10 min，弃上清，收集沉淀液于－20℃冻存。

1.2.4 HDAg的制备及纯化 将冻存的菌液用0.05 mmol／L PB溶解，在冰浴条件下超声波破碎，将破碎的菌液以8 000 r／min离心10 min，取上清，用饱和硫酸铵沉淀，至终浓度为400 mL／L。将沉淀液以8 000 r／min离心10 min。弃上清，留沉淀，用去离子水透析过夜除去硫酸铵，再用4 mol／L尿素溶解，将溶液按照Ni－NTA亲和层析柱产品使用说明纯化蛋白。

1.2.5 方阵滴定法确定最佳酶标抗原浓度 对纯化的抗原进行辣根过氧化物酶标记（改良过碘酸钠法），作为酶标抗原 HRP－HDAg，按照 1／500、1／1 000、1／1 500、1／2 000进行稀释，用0.05 mol／L p H 9.5～9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗人Ig M（μ链）单克隆抗体200、100、50 ng／100μL包被聚苯乙烯板。采用方阵滴定法确定单抗最佳包被浓度和酶标最佳稀释度。

1.2.6 阴阳性判定 用建立捕获法，根据ELISA检测方法临界值（Cut off）的经验公式：临界值＝2.1×阴性对照孔吸光度值均值；通过对15例病理样本的检测，检验参考值的合理性。

1.2.7 交叉反应试验 用建立的捕获法分别与HIV、HAV、HCV、HEV阳性血清反应（血清经医院检测HDV为阴性，使用前已经灭活），同时选取HDV阳性血清和阴性血清作为阳性对照和阴性对照，每孔做复孔 。

2 结果

2.1 目的片段的扩增和重组质粒构建

应用PCR方法从pETHD质粒中扩增到约500 bp的DNA条带，片段与预期设计相符（图1）。将回收片段连接于pET－30a表达质粒，获得pET－30a／HDAg重组表达质粒。经转化TG1宿主菌，提取质粒进行Bam HⅠ、Hin dⅢ 双酶切鉴定（图2）。

2.2 目的蛋白的诱导表达

SDS－PAGE显示IPTG的最佳诱导浓度为0.1 mmol／L，最佳诱导时间为6 h，最佳诱导温度为37℃。表达产物大小约为27 ku，与设计相符。此条件下目的蛋白表达量最大，在上清和沉淀中均有蛋白HDAg，扫描分析上清表达量占总体电泳蛋白条带的25%左右（图3）。

2.3 表达产物纯化及SDS－PAGE电泳分析

从SDS－PAGE电泳结果可以看到，经过20 mmol／L咪唑洗脱收集的目的蛋白含有少许杂蛋白；经过50 mmol／L咪唑洗脱收集的蛋白纯度较高，含量较高。扫描分析其纯度可达95%以上（图4）。

2.4 方阵滴定法确定最佳酶标抗原浓度和抗体包被浓度

通过方阵滴定包被抗体最佳工作浓度为100 ng和酶标抗原工作浓度为1／1 000组合时，P／N比值最大（表1）。

表1 包被单抗和酶标抗原的确定Table1 Determination for optimal concentration of Mc Ab and HRP－HDAg

2.5 阴阳性判定

根据酶免检测方法临界值（Cut off）的经验公式：临界值＝2.1×阴性对照孔吸光度值均值。当阴性对照吸光度值均值小于0.05以0.05计算；当阴性对照吸光度值大于等于0.05以实际值计算。一般阴性对照吸光度值均值小于0.05（参照表1，阴性均值），因此确定阴性血清HDV Ig M正常值上限为0.105。检测值低于0.105判为阴性，检测值高于0.105判为阳性，通过对15例病理样本的检测，均在0.2以上。

2.6 交叉反应试验

用建立的捕获法分别与 HIV、HAV、HCV、HEV阳性血清反应，结果均为阴性，说明表达的HDAg对丁型肝炎病毒Ig M具有特异性（表2）。

表2 交叉反应结果Table2 The results of cross－reaction

3 讨论

目前利用基因工程表达HDAg已有不少报道［8－10］，表达的抗原编码区基因在230 bp～680 bp之间，表达蛋白以融合蛋白［9］或包涵体［10］形式存在，蛋白纯度达到90%，均具有抗原性［11］。本研究扩增编码区500 bp，与p ET－30a载体连接，重组表达质粒pET－30a／HDAg，经转化 BL21（DE3）诱导，经SDSPAGE分析，蛋白分子质量为27 ku，蛋白在破碎后菌液上清和沉淀中均有。选择上清溶液用400 g／L过硫酸铵沉淀目的蛋白，后用Ni－NTA亲和层析纯化，蛋白的纯度达到95%以上，通过ELISA和交叉反应试验，表明反应原性和特异性较高。

p ET－30a中的S·Tag标签是高度可溶的多肽，可增强一些蛋白的可溶性，并且p ET－30a在N端编码6个连续的His－Tag作为亲和臂（Affinity－Tag），使所得的重组蛋白能通过金属离子（Ni2＋）配体亲和层析快速纯化。

目前对于丁型肝炎病毒的检测有PCR法、分子杂交法和ELISA法，前两种方法主要是检测HDVRNA，目前对此尚无统一的标准。ELISA主要是检测Ig M和IgG，IgG在丁型肝炎病毒感染后可检出，Ig M抗体在丁型肝炎病毒早期感染可检出。对HDV感染尚无特效治疗药物，切断HDV的传播途径是主要预防措施之一，早期诊断对HDV感染的预防和控制有着重要意义。谢立等［12］对表达的抗原进行HRP标记，检测丁型肝炎病毒Ig M抗体，灵敏度高，特异性好。本研究利用表达的抗原初步建立捕获法，通过方阵滴定确定包被抗人Ig M（μ链）单克隆抗体最佳工作浓度为100 ng和HRP－HDAg工作浓度为1／1 000组合时，P／N比值最大，通过交叉反应试验，结果表明，表达的抗原具有很好的反应原性和特异性，可为建立丁型肝炎病毒早期检测试剂盒提供材料来源。

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