猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

吴 炜，张晓燕，唐宇龙，方丽华，方维焕

（浙江大学动物预防医学研究所，浙江省动物预防医学重点实验室，浙江杭州310058）

猪链球菌2型（Streptococcus suis 2，SS2）是猪链球菌各个血清型中毒力最强、流行最广泛的血清型，是重要的人兽共患病病原［1］。猪链球菌溶血素（suilysin，SLY）是较早确定的猪链球菌毒力因子之一，属巯基活化的溶细胞素家族（thiol activated cytolysin group，TACY）溶血素，序列分析表明SLY具有该家族的同源保守序列，且此序列与细菌的溶血活性有重要关系。Staats J J等［2］报道19株链球菌2型菌株中有5株SLY为阳性，而这5株菌都是高毒力株，而其他SLY为阴性的菌株都是低毒力或无毒力株。研究表明，溶血素可以增强SS2对上皮细胞的侵袭和裂解能力［3］；溶血素阳性菌株的黏附和细胞毒性在脑膜炎过程中起作用［2］。对溶血素基因分析表明，强毒力菌株大多携带sly基因，而低致病力菌株不溶血，且其5′端多有突变或缺失［4］。

本研究利用pSET4S温敏性自杀质粒，通过同源重组方法构建sly基因缺失株，分析突变株的生物学特性，为进一步研究SLY介导SS2的感染生物学机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

猪链球菌2型分离株1105为浙江省动物预防医学重点实验室于2008年分离自病猪肺脏的强毒株；E.coli DH5α由浙江省动物预防医学重点实验室保存；pSET4S质粒由日本国家动物健康研究所（National institute of animal health，Japan）Daisuke Takamatsu博士惠赠；脑微血管内皮细胞Bend3和小鼠单核巨噬Raw246.7为浙江省动物预防医学重点实验室保存；脑心浸出液培养基（Brain heart infusion，BHI），Tryptone和 Yeast extraction为OXOID公司产品；氯霉素和大观霉素为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；引物由上海Invitrogen生物技术有限公司合成；DNA割胶回收和纯化试剂盒为Axygen公司产品；质粒抽提试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品；T4连接酶和DNA限制性内切酶均为Takara公司产品；雌性Balb／c小鼠购自浙江省中医院动物试验中心。

1.2 方法

1.2.1 同源重组质粒的构建

1.2.1.1 自杀载体元件的PCR扩增 构建重组质粒pSET4S：：cat－ΔSly：根据 NCBI上猪链球菌2型P1／7标准株的基因（NC－012925.1）中的 Sly序列（1258902－1262814）设计引物（表1）。PCR反应条件及体系：10×buffer 3μL，10 mmol／L d NTP 1.0 μL，上游引物 1.0μL，下游引物1.0μL，template 2.5μL，super Tag 0.5μL，dd H2O 21μL。PCR反应程序为：94℃3 min；94℃30 s，54℃40 s，68℃90 s，30个循环；68℃继续延伸10 min。PCR产物用10 g／L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.1.2 自杀载体元件的酶切和连接 用引物Sly－1／Sly－2和Sly－3／Sly－4分别扩增Sly－5′和Sly－3′片段，PCR扩增产物割胶回收纯化后，分别用引物Sly－1／4进行融合PCR扩增。割胶产物片段用Eco RⅠ和SphⅠ双酶切3 h，再回收纯化，得到的片段和经过相对应双酶切处理的pSET4S用T4连接酶过夜连接，构建自杀质粒pSET4S－ΔSly。用引物CH1／CH2从p MD18T－cat中PCR扩增cat基因，Eco T22I酶切处理pSET4S－ΔSly与cat基因PCR产物，用T4连接酶过夜连接，构建得到带cat基因的pSET4S：cat－ΔSly（图1）。

表1 构建重组自杀载体所用PCR引物Table1 Primers used for construction recombinant suicide vector

图1 pSET4S：cat－Δsly质粒构建示意图Fig.1 Schematic representation of the procedures for construction of pSET4S：cat－Δsly

1.2.1.3 自杀质粒的鉴定和测序 将pSET4S：cat－ΔSly转化至E.coli DH5α感受态细胞，选择含抗性Spc 50μg／mL，Cm 8μg／mL的LB固体培养基筛选阳性克隆，并送上海Invitrogen生物技术有限公司测序。

1.2.2 猪链球菌2型菌株感受态的制备与电转参考 Takamatsu D等［5］SS2感受态的制备方法，电转条件为2 500 V、25 m A和200Ω。将pSET4S：cat－ΔSly电转至SS2－1105菌株内，利用含抗性Spc 100μg／mL和Cm 4μg／mL的BHI平板筛选阳性菌株，进行PCR扩增，鉴定并比较同源臂片段大小。

1.2.3 插入cat抗性基因法同源重组筛选sly基因缺失株 将鉴定电转成功的SS2菌株，先于含Spc和Cm抗性BHI培养基中28℃培养16 h至对数生长期中期，然后1∶1 000转接至新鲜的只含Cm抗性BHI培养基中，28℃培养6 h至对数生长期早期，将细菌从28℃培养箱移至37℃培养箱继续培养，4 h后取100μL涂板（只含Cm抗性BHI平板），37℃培养过夜，24 h后挑斑PCR鉴定（鉴定Spc抗性基因是否消除和比较同源臂片段大小），构建得到以SS2－1105为亲本株的sly基因缺失株，即SS2－1105－Δsly。插入cat的sly基因片段临近区域再经PCR鉴定和测序验证（鉴定引物P1：AGCTTGA CTTACGAGCCACAAG AG；P2：CCACCATTCCCAAGCTAAT CCTGT，可以扩增亲本菌株完整的sly－ORF）。

1.2.4 体外溶血试验 根据 Ono T等［6］建立的方法加以改进，测定突变株与亲本株在全血中的溶血活性。方法如下：①从绵羊血中分离红细胞，配成50 mL／L的 RBC－1640悬液；②取5 mL 37 ℃过夜培养物5 000 r／min离心6 min收集菌体，用灭菌10 mmol／L PBS洗两遍，用适量PBS重悬细菌，调整菌株浓度至109cfu／mL；③取10μL细菌悬液（即实际细菌量在107cfu左右）与500μL浓度为50 mL／L RBC－1640悬液加入 EP管中，2000 r／min离心2 min后，37℃静置培养。每个菌株设3个平行，每1 h为一组，共设6组（包括0 h组），每组设阴性与阳性对照各3管（用PBS代替细菌悬液）。每隔1 h取出一组，在阳性对照中加入Triton X－100至终浓度2 mL／L，剧烈震荡后12 000 r／min离心1 min，取上清200μL测定OD570 nm值；其余处理管温和颠倒混匀后12 000 r／min离心1 min，取上清200μL测定OD 570 nm值。样品与相应时间点阴性OD 570 nm值分别取平均值后的差值作图。

1.2.5 对Bend3脑血管内皮细胞毒性试验Bend3细胞为鼠源的脑血管内皮细胞，培养于含100 mL／L胎牛血清的1640培养基，铺于96孔细胞培养板中，4×104／孔～6×104／孔。亲本株及缺失株复苏后，1∶100转接至新鲜BHI培养基中，培养3 h～4 h至对数生长期中期，用灭菌的10 mmol／L PBS洗两遍，调节 OD 600nm值至0.5左右，10倍稀释于1640基础培养液中，每孔加入100 μL含细菌的培养液（加入菌液前，细胞先弃上清，后用用温浴灭菌的10 mmol／L PBS清洗细胞3遍），使细菌与细胞的MOI为1∶1 000。37℃体积分数为5%的CO2培养，设立自身释放LDH的阴性对照与裂解细胞的阳性孔，每加样孔3个平行。在1 h和2 h培养后，吸取50μL细胞上清液至96孔微量反应板，加入底物显色液50μL，黑暗反应30 min，再加入50μL反应终止液，490 nm酶标仪进行检测读数。细胞毒性的计算方法：（试验孔值－细胞LDH自身释放值）／（细胞完全裂解释放LDH阳性值－细胞LDH自身释放值）×100%。

1.2.6 在Raw246.7巨噬细胞中存活力 用含100 mL／L胎牛血清的1640培养基培养Raw246.7细胞，铺于24孔培养板中，2×105个／孔～4×105个／孔。亲本株及突变株复苏后，按上述方法培养和洗涤，调节OD 600 nm至0.5左右，10倍稀释至含100 mL／L胎牛血清的1640细胞培养液中，每孔加入500μL含细菌的培养液，使细菌与细胞的MOI为1∶100。在37℃、体积分数为CO2培养箱中培养45 min后弃去细胞孔中液体，用温浴灭菌的10 mmol／L PBS清洗细胞3遍，加入终浓度为100μg／mL庆大霉素的1640培养基，在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养1 h后，弃去上清，用温浴灭菌的10 mmol／L PBS清洗细胞3遍，加入含100 mL／L的胎牛血清的1640细胞培养，在37℃、体积分数为5%的CO2细胞培养箱内继续放置1、2、3 h。处理完的孔先用PBS洗细胞3遍，后用100μL胰酶处理10 min，再用冰浴的灭菌蒸馏水使细胞裂解，裂解液10倍连续稀释后，去适当稀释度的菌液进行平板计数。

2 结果

2.1 同源重组质粒和sly基因缺失突变SS2菌株的鉴定

用于同源重组的自杀质粒pSET4S：cat－Δsly，用PCR扩增同源臂片段（引物Sly－1／4）进行鉴定，大小为3 523 bp，比SS2基因组的同源片段短约390 bp（图2）。重组质粒转化到E.coli DH5α中，提取质粒对目的片段进行测序，与参考菌株菌株P1／7的基因序列（NC－012925.1）同源性98.5%以上，表明目的片段已经成功克隆于载体。

通过28℃和37℃细菌传代后质粒凋亡，同源重组完成，突变株通过PCR扩增鉴定（图3）。用sly两侧特异引物扩增亲本菌株的ORF片段为1 491 bp，而SS2－Δsly突变株扩增携带有cat基因和部分sly基因片段为1 103 bp（图4），经序列测定和分析，扩增片段内含cat基因。

2.2 缺失突变株SS2－1105－ΔSly体外溶血活性消失、细胞毒性显著降低

图4表明，亲本株的溶血活性从0 h时刻到2 h时持续升高，而sly基因缺失株的溶血消失。突变株SS2－1105－ΔSly对小鼠脑微血管内皮细胞的细胞毒性显著低于亲本株（图4），说明溶血素是SS2对Bend3细胞产生损伤的主要毒力因子。

图4 溶血素缺失株SS2－ΔSly与亲本株体外溶血活性（左）和细胞毒性（右）比较Fig.4 Comparison between sly deletion mutant and its wild－type strain in hemolytic activity（left）and cytotoxicity（right）

2.3 缺失株SS2－1105－ΔSly在 Raw246.7细胞中的存活力

将各时间点的细菌数除以相对应菌株0时刻（庆大霉素处理1 h）的起始细菌总数，得到对应的细菌在巨噬细胞内的存活率。SS2亲本菌株在Raw246.7细胞中的存活率随共培养时间的增加逐渐降低，溶血素基因缺失株在细胞中的存活能力并没明显变化（图5），初步表明溶血素不影响对SS2在巨噬细胞中的存活。

3 讨论

猪链球菌2型是重要的人兽共患致病菌，但其致病机制还不完全清楚［7］，研究表明猪溶血素SLY在其致病过程中起重要作用，是一种重要的毒力因子［8］。SLY对不同的上皮细胞系，脑微血管内皮细胞和巨噬细胞等有细胞毒性。SLY可能在猪链球菌致脑膜炎过程中起作用，但具体的作用机制还不清楚［9］。

图5 溶血素缺失株SS2－ΔSly与亲本株在RAW264.7巨噬细胞内存活力比较Fig.5 Comparison between sly deletion mutant and its wild－type strain in survival within macrophage cell line RAW264.7

猪溶血素还是良好的保护性抗原［10］。Jacobs A A等［11］将猪链球菌2型的SLY提纯后免疫Balb／c小鼠，小鼠得到了完全的免疫保护，证明SLY具有重要的免疫保护作用，并推测猪链球菌2型的溶血素同时对其他类型的猪链球菌有交叉保护作用。Jacobs A A等［12］进一步将SLY与猪链球菌2型的其他细胞外抗原（extracellular antigens）对猪的免疫保护作用进行了对比，证实SLY的免疫保护作用要明显优于不含溶血素的其他细胞外抗原。Institut M等［13］利用天然缺失猪溶血素的2型和9型猪链球菌进行活苗的保护力试验，但结果并没有产生抗体和免疫力。Lun S等［14］研究认为，猪链球菌2型的溶血素可能并不介导细菌对呼吸系统的感染，但在刺激细胞因子释放和先天免疫过程中具有一定作用。然而，SLY在脑内感染中是否起作用，如何起作用还未见相关研究报道。

本研究利用p EST4S温敏性自杀质粒，通过同源重组和抗性基因置换构建sly基因缺失突变株，通过温度和抗性基因两个选择压力，提高了获得阳性突变株的概率，为在细胞和分子水平深入研究SLY在SS2致病中的作用奠定了基础。

［1］闽成军，刘亚彬.猪链球菌的致病性［J］.动物医学进展，2010，31（2）：257－259.

［2］Staats J J，Plattner B L，Nietfeld J，et a1.Use of ribotyping and haemolysin activity to identify highly virulent Streptococcus suis type 2 isolates［J］.Clin Microbiol，1998，36：15－19.

［3］Lalonde M，Segura M，Lacouture S，et al.Interactions between Streptococcus suis serotype 2 and diferent epithelial celllines［J］.Microbiololgy，2000，146：1913－1921.

［4］Staats J J，Plattner B L，Stewart G C.Presence of the Streptococcus suis suilysin gene and expression of MRP and EF correlates with high viulence in Streptococcus suis type 2 isolates［J］.Vet Microbiol，1999，70：201－211.

［5］Takamatsu D，Osaki M，Sekizaki T.Thermosensitive suicide vectors for gene replacement in Streptococcus suis ［J］.Plasmid，2001，5（46）：140－148.

［6］Ono T，Park K S，Ueta M，et al.Identification of proteins secreted via Vibrio parahaemolyticus typeⅢsecretion system 1［J］.Infect Immun，2006，74（2）：1032－1042.

［7］Poyart C，Pellegrini E，Gaillot O，Contribution of Mn－cofactored superoxide dismutase （Sod A）to the virulence of Streptococcus agalactiae［J］.Infect Immun，2001，3（69）：5098－5106.

［8］Fittipaldi N，Fuller T E，Teel J F，et al.Serotype distribution and production of uramidase－released protein，extracellular factor and suilysin by field strains of Streptococcus suis isolated in the United States［J］.Vet Microbiol，2009，11（139）：310－317.

［9］Gottschalk M，Segura M.The pathogenesis of the meningitis caused by Streptococcus suis：the unresolved questions ［J］.Vet Microbiol，2000，10（76）：259－272.

［10］Lv Q Y，Hao H J，Bi L L，et al.Purification and biological activities analysis of Streptococcus suis serotype 2 suilysin［J］.Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2011，27，（4）：374－376.

［11］Jacobs A A，Loeffen P L，van den Berg A J，et al.Identification，purification，and characterization of a thiol－activated hemolysin（suilysin）of Streptococcus suis ［J］.Infect Immun，1994，62（5）：1742－1748.

［12］Jacobs A A，van den Berg A J，Loeffen P L.Protection of experimentally infected pigs by suilysin，the thiol－activated haemolysin of Streptococcus suis ［J］.Vet Rec，1996，139（10）：225－228.

［13］Insitiut M，Zentum I，BIischofsholer D，et al.Intranasal immunization with a live Streptococcus suis isogenic of mutant elicited suilysin－neutralization titers but failed to induce opsonizing antibodies and protection［J］.Vet Immunol Immunopathol，2009，15（132）：135－145.

［14］Lun S，PereZ－Casal J，Connor W，et al.Role of suilysin in pathogenesis of Streptococcus suis capsular serotype 2 ［J］.Microb pathog，2003，34（1）：27－37.