免疫组化法检测犬瘟热病毒在貉组织内的分布

张文奎，赵红艳，龙 淼，郭 洋，王凤龙

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018；2.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866；3.本溪市动植物园管理办公室，辽宁本溪117000）

犬瘟热是由犬瘟热病毒（CDV）引起的烈性、高致死性传染病［1］，易感动物包括犬科、浣熊科、猫科、海豹科等［2］。除了犬之外，我国北方饲养的毛皮动物狐狸、貉、貂都是犬瘟热病毒的易感动物，此病对皮毛兽养殖造成很大危害。一旦养殖户因未及时给动物接种疫苗而造成发病，往往引起大群死亡［3］。即使在疫苗广泛使用的前提下，还会经常出现犬瘟热发生。因此，早期诊断是防治犬瘟热的重要前提。目前对于犬瘟热的诊断有了大量的报道，但对于采用HE及免疫组化的方法进行犬瘟热病毒的组织定位研究报道很少。虽然一些报道描述了该病毒存在于一些有限的器官，如肺、脑、肾、肠道、脚垫、淋巴器官［4－5］，但CDV在貉的各个组织中的分布规律及究竟哪些组织器官最适宜进行病理学诊断还尚未有人研究。本研究采用HE染色方法对犬瘟热感染的病貉进行CDV组织包涵体检测，并采用免疫组化方法证明貉发生犬瘟热时CDV在组织脏器中的分布规律，进而确定哪些织器官最适宜于进行犬瘟热诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 2010年－2011年，在辽宁地区共搜集到犬瘟热确诊病貉79只，患貉病程从1周到1个月不等。根据临床症状怀疑为犬瘟热，经过问诊，这些病貉没有被注射过疫苗，表现的临床症状多种多样，包括鼻腔有大量分泌物、咳嗽、肺炎、腹泻、结膜炎、结痂、硬足垫及神经综合征。剖检的主要症状是肺炎，肠炎，脾、胸腺、淋巴结萎缩。通过犬瘟热免疫试纸条法确诊所搜集的貉为犬瘟热病貉。

1.1.2 样本采集 犬瘟热病貉的肺、脑、肾、胃、脾、淋巴结、扁桃体、鼻、足垫、支气管。

1.1.3 试剂与仪器 犬瘟热单克隆抗体（美国维尔康WELLCAN）为北京宠必威生物科技有限公司产品；DAB显色剂为北京博奥森生物技术有限公司产品；抗原修复液、封闭用羊血清、抗体稀释液和山羊抗小鼠IgG抗体－HRP多聚体二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；QPJ－1B切片机为天津天利航空机电有限公司产品；OLYMPUS显微镜为广州思贝舒检测仪器公司产品；PAP笔（ZLI－9070）和防脱磨砂载玻片为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 切片制作 将固定于100 mL／L中性福尔马林溶液中的肺、脑、肾、胃、脾、各种淋巴结、扁桃体、脚垫、鼻常规石蜡包埋制块，切片（3μm），捞于防脱磨砂载玻片上，50℃烤片5 h，37℃温热过夜。

1.2.2 HE染色 根据王凤龙编写的动物病理及检验技术中HE染色步骤进行［6］。

1.2.3 免疫组化染色 石蜡切片脱蜡至水：二甲苯Ⅰ15 min；二甲苯Ⅱ10 min；1 000 mL／L乙醇Ⅰ5 min；1 000 mL／L乙醇Ⅱ5 min；950 mL／L乙醇5 min；900 mL／L 乙 醇 5 min；700 mL／L 乙 醇5 min，蒸馏水冲洗2 min×3次，PBS液浸泡5 min×3次；擦掉切片上组织周围的液体，用PAP笔在组织周围划圈，放入底部盛有PBS的湿盒中，滴加30 mL／L H2O2阻断剂于组织上，室温避光孵育20 min，PBS液冲洗，5 min×3次；血清封闭：羊血清工作液滴加在组织上，37℃孵育30 min，甩掉血清，勿冲洗；滴加抗体稀释液1∶100稀释的犬瘟热单克隆抗体，4℃过夜（14 h以上）；阴性对照加PBS；37℃复温45 min，PBS洗，5 min×3次；滴加山羊抗小鼠IgG抗体－HRP多聚体二抗，37℃孵育60 min，PBS冲洗，5 min×3次；DAB显色：先将DAB试剂中的A液一滴加入1 mL蒸馏水中混匀，再加入1滴B液和1滴C液混匀使用，现用现配。滴加在组织上显色3 min～10 min，显微镜下控制显色；切片入蒸馏水，再用自来水冲洗终止显色；苏木素复染：在苏木素中染色4 min；自来水冲洗，蒸馏水浸泡；盐酸酒精分化；自来水泛蓝20 min；酒精梯度脱水；二甲苯透明；中性树胶封片。

2 结果

免疫组化法检测犬瘟热病毒在犬瘟热病貉体内的分布规律如图1所示，所检测病貉共79只，在病貉各个组织器官检测到犬瘟热病毒的比例如下：在肺部占72%，大脑占24%，膀胱占74%，胃占80%，脾占77%，淋巴结占80%，扁桃体占100%，足垫占89%，鼻黏膜占87%，支气管占90%。表明CDV在犬瘟热病貉扁桃体分布最广，在其他组织器官也有广泛的分布。

图1 免疫组化法检测犬瘟热病毒在貉组织器官的分布比例Fig.1 Distribution rate of canine distemper virus in the various tissues of the raccoon dogs

在光镜下观察HE染色组织切片，发现在肾小管上皮细胞中包涵体成红染圆形团块（图2A），小脑颗粒层细胞内见包涵体为卵圆形红染团块（图2B），肺泡壁细胞内出现卵圆形红染团块包涵体（图2C），在脾脏，淋巴细胞减少，在网状内皮细胞内可见嗜酸性包涵体（图2D）。免疫组化结果表明，除了上述器官之外，在足垫颗粒层细胞内有阳性着色颗粒（图3A），鼻头颗粒层细胞与角质层内有散在阳性信号（图3B），支气管上皮细胞胞浆内见强阳性信号（图3C），扁桃体网状内皮细胞出现强阳性信号（图3D）。淋巴器官变化很大，主要是扁桃体、脾脏和淋巴结显著萎缩并伴有淋巴数量减少，嗜酸性胞内包涵体在网状内皮细胞和淋巴细胞内大量出现。

3 讨论

死后检测CDV是确定犬瘟热感染最准确的方法。由于CDV的自然亲嗜细胞是上皮细胞，因此以前的研究中，胃黏膜、眼结膜、肾黏膜被认为是检测CDV最可靠的器官［7］。但在我们的研究结果显示的是包涵体在扁桃体的检出率要高于其他器官。居于第二位的是呼吸系统的各个器官。CDV在淋巴组织复制并经由被感染的淋巴细胞传播到其他组织。由于自然传播途径是经过吸入途径［1，8］，病毒的复制应该首先在呼吸道的淋巴组织细胞进行。因此，CDV 能在扁桃体早期阶段检测到［1，9］。CDV 感染在早期阶段可引起淋巴组织中的T细胞和B细胞显著减少，这和其他麻疹病毒属的病毒如（麻疹病毒、牛瘟病毒）传染的特点一样［10］。事实上，很多研究支持这样的传染过程［1，9］，并且大量的 CDV 在早期直至晚期都可以存在淋巴器官，而且在淋巴器官内检测到，尤其是扁桃体［11］。

本试验也进行了HE组织学检验，观察包涵体的存在，但该方法没有免疫组化法敏感，采用HE染色没有在足垫上皮细胞和鼻头上皮细胞检测到包涵体，但是采用免疫组化的方法确定了CDV病毒在此部位的存在。而且有文献报道，采用免疫组化的方法对足垫上皮细胞及鼻头上皮细胞CDV的检测，是对犬瘟热生前诊断的最佳组织［12］。

本研究采用免疫组化法确定了CDV在犬瘟热病貉组织的分布特点，为病理组织学确诊貉犬瘟热诊断提供参考。本研究结果表明最适宜确诊貉犬瘟热的病理组织学检查器官是扁桃体。

图2 HE染色组织切片，光镜下观察Fig.2 HE staining sections under light microscopy

图3 免疫组化法检测犬瘟热病毒在貉部分器官中的分布Fig.3 The distribution of CDV in tissue samples by immunlhistochemistry detection

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