枣果中环磷酸腺苷(cAMP)的提取工艺及含量测定*

张明娟，李薇，庞晓明

1(北京林业大学生物科学与技术学院，北京，100083)

2(中国食品发酵工业研究院，北京，100027)

枣果中环磷酸腺苷(cAMP)的提取工艺及含量测定*

张明娟1，2，李薇1，庞晓明1

1(北京林业大学生物科学与技术学院，北京，100083)

2(中国食品发酵工业研究院，北京，100027)

大枣中的环磷酸腺苷(cAMP)含量丰富而且稳定，在已测的动植物材料中居首位。试验采用超声水浴提取的方法，考察超声时间、乙醇浓度、料液比3个因素对cAMP提取率的影响，结果表明料液比为主要影响因素，超声时间、乙醇浓度次之;确定了cAMP最佳提取工艺:料液比1∶25，乙醇浓度15%，超声时间20 min。并采用高效液相色谱法测定了8种枣果中的cAMP的含量，最高的为朝阳圆枣(375.61 μg/g)，最低为1-早脆王(46.01 μg/g)。

枣果，环磷酸腺苷，提取，高效液相色谱法

环磷酸腺苷(cAMP)分子式为:Cl0H12N5O6P·H2O，水合物为类白色或淡黄色结晶，微溶于水，不溶于乙醇或乙醚;熔点为219～220℃(分解)，比旋度为-51.3°(C=0.67);它对酸、碱、热都相当稳定[1］。cAMP是人体中的一种重要生物活性物质，它是细胞内传递激素和递质的中介因子，并作为第二信使参与多种生理生化过程的调节，对心肌梗塞、冠心病、心源性休克、牛皮癣等疾病有显著疗效[2，3］。cAMP 和cGMP分别是由Sutherland于1957和Prie于1963年最早从哺乳动物组织中发现的，其中Sutherland因发现cAMP于1971年获得生理和医学诺贝尔奖。之后，人们相继从植物和微生物中发现了环腺苷酸，并证明二者是生物界普遍存在的两种生物活性物质[4］。据文献报道，枣中cAMP含量在已测动植物中是最高的，是一般动植物的数千至数万倍[5，6］。因而枣中环磷酸腺苷颇具开发利用价值。本次试验对枣中环磷酸腺苷的提取工艺进行优化并采用高效液相色谱对所采集的8种枣果环磷酸腺苷含量进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

1.1.1 材料

朝阳圆枣、18-无核枣、1-马牙枣、1-早脆王、51-1蜂蜜罐、3018小枣、金丝硕丰 、158溆浦鸡蛋枣，以上枣果都采自北京林业大学沧州枣基地。

cAMP标准品(纯度98%):日本WAKO公司，甲醇(色谱纯):北京化工厂生产，无水乙醇(分析纯):北京化工厂生产，磷酸二氢钾(分析纯):北京化学试剂公司生产，蒸馏水。

1.1.2 仪器

岛津LC-10A高效液相色谱仪:日本岛津制作所，Venusil MP C18色谱柱(4.6×250×5 μm):Agela Technologies，HERAEUS BIOFUGE PRIMO R 冷冻离心机，KQ-500E型超声清洗器:昆山市超声仪器有限公司，RE-5203旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂，HETO POWER DRY LL1500冷冻干燥机，PL403电子天平:梅特勒-托利多仪器有限公司，0.45 μm微孔滤膜，0.45 μm微孔滤头，1 mL一次性使用无菌注射器，平头25 μL微量进样器。

1.2 标准品溶液的制备

精密称取cAMP标准品5.0mg于50 mL容量瓶中，加入蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀得100μg/mL储备液。

分别吸取 0.25、0.75、1.25、2.50、3.75 mL 至 25 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。得到1、3、5、10、15μg/mL 的标准品溶液。

1.3 样品溶液的制备

先将8种枣果分别切成片状，冷冻干燥2 d，用粉碎机磨成粉状。准确称取各枣粉1.00 g，用25 mL 15%乙醇溶解，超声提取20 min，然后放入80℃[7］的水浴中振荡提取4 h，以3000 r/min冷冻离心5min，取上清液置入100 mL浓缩瓶中。残渣再加10 mL 15%乙醇溶解，80℃的水浴中振荡20 min后3000 r/min冷冻离心5 min，所得上清液合并入上述浓缩瓶中。将上清液真空浓缩后转入25 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，过0.45 μm微孔滤膜，用高效液相色谱法进行测定[8］。

1.4 色谱检测条件

色谱柱:Venusil MP C18(4.6×250×5 μm)，流动相:甲醇与20mmol/L磷酸二氢钾(体积比20∶80)，流速:1 mL/min，温度:室温，检测波长:254 nm，进样量:15 μL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

环磷酸腺苷标准品色谱图如图1，标准曲线图如图2。

图1 标准品的高效液相色谱图(15μg/mL)

图2 标准曲线图

2.2 提取条件优化

2.2.1 料液比对朝阳圆枣中cAMP提取率的影响

在超声时间15 min，乙醇浓度15%的条件下，选取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶255个料液比水平研究对cAMP提取率的影响[8］，见图3。

从图3可知，随着料液比的增加，提取率增加，1∶10之后提取率趋于平缓。因此可选出用于正交实验中的料液比的3 个水平为1∶15，1∶20，1∶25。

2.2.2 乙醇浓度对朝阳圆枣中cAMP提取率的影响

在料液比1∶15，超声时间15 min的条件下，选取乙醇浓度10%、15%、20%、50%、80%5个料液比水平研究对cAMP提取率的影响，见图4。

图3 料液比对cAMP提取率的影响

图4 乙醇浓度对cAMP提取率的影响

从图4可知，随着乙醇浓度的增大，提取率增大，在15%时达到最大值，之后随浓度的增大提取率降低，这可能和cAMP在乙醇中的溶解性有关。因此可选出用于正交实验的乙醇浓度的3个水平为10%，15%，20%。

2.2.3 超声时间对朝阳圆枣中cAMP提取率的影响

在料液比1∶15，乙醇浓度15%的条件下，选取超声时间 5、10、15、20、25min 五个料液比水平研究对cAMP提取率的影响，见图5。

图5 超声时间对cAMP提取率的影响

从图5可知，随着超声时间的延长，提取率增加，在15 min时达到最大值，之后随时间的延长提取率降低，可能是超声时间过长，细胞中其他物质溶出，影响cAMP的提取。因此可选出用于正交实验的超声时间的3 个水平为10，15，20 min。

2.2.4 正交试验结果

在单因素实验的基础上，选取乙醇浓度、料液比、超声时间进行3因素3水平正交试验，按L9(34)正交表安排试验，重复2次。试验结果见表1。

表1 正交实验结果及极差分析

由极差分析可以得出A因素对提取效果影响最大，其次是C、B因素，即各因素作用影响顺序为:料液比＞超声时间＞乙醇浓度。提取枣中cAMP的最优的水平组合为A3B2C3，即料液比1∶25，乙醇浓度15%，超声时间20 min。

2.2.5 优化方案的确定

取正交实验最优组合A3B2C3与表1中提取率最高的组合A3B2C1进行验证试验，正交实验最优组合A3B2C3得到的朝阳圆枣 cAMP为375.61μg/g，而表1中提取率最高的组合A3B2C1得到的朝阳圆枣cAMP为361.11 μg/g，因此以正交实验最优组合A3B2C3为最优提取条件。

2.3 八种枣果中cAMP含量

应用高效液相色谱测定八种枣果中的cAMP的含量，结果见表2和图6。

表2 8种枣果cAMP含量

图6 8种枣果cAMP含量比较

由图6可知，所测定的不同品种枣中cAMP含量差异很大，最高为朝阳圆枣(375.61 μg/g)，最低为1-早脆王(46.01 μg/g)。

3 结论

试验可知超声时间、乙醇浓度、料液比对cAMP的提取有不同的影响，各因素作用主次顺序为:料液比＞超声时间＞乙醇浓度。枣中cAMP提取的最优条件为料液比1∶25，乙醇浓度15%，超声时间20 min，在此条件下朝阳圆枣的cAMP含量为375.61 μg/g。

试验中所测定的8个不同品种的枣以前均无文献报道，本文首次测定了该8个品种枣的cAMP含量。试验结果为cAMP含量最高的是朝阳圆枣(375.61 μg/g)，最低是1-早脆王(46.01 μg/g)，由此说明枣的不同品种间cAMP含量的差异很大。

cAMP是一种重要的生理活性物质，对人体健康起着重要的作用，而在本实验已测的8种枣中，朝阳圆枣中cAMP的含量显著高于其他枣，因此在生产枣类制品时，可优先使用此类枣，以使其制品具有更高的营养价值和商业价值。

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ABSTRACTThe cAMP content is abundant and stable in jujubes，and is the highest in animals and plants tested so far.This paper used the method of ultrasound and water bath extraction to study the effect of three factors(time of ultrasound，concentration of alcohol，solid-liquid ratio)on the extraction rate of cAMP.The result showed that solid-liquid ratio was the main influencing factor，ultrasonic time，concentration of alcohol was then followed.The best extraction process of cAMP was:solid-liquid ratio 1∶25，solvent concentration15%，ultrasonic time 20min.The paper also used high performance liquid chromatographic to determine cAMP content in eight kinds jujubes，and it showed that chaoyangyuanzao had the highest(375.61μg/g)content，1-zaocuiwang had the lowest(46.01μg/g)content.

Key wordsjujubes，cAMP，extraction，HPLC

Study on Extraction cAMP from Jujubes and Its Quantitative Determination

Zhang Ming-juan1，2，LI Wei1，Pang Xiao-ming1，Wang Feng-juan1
1(Couege of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry Universty，Beijing 100083，China)
2(China National Research institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027，China)

硕士研究生(王丰俊副教授为通讯作者;E-mail:010100083@163.com)。

*中央高校基本科研业务费专项资金(JD2010-5)，林业公益性行业科研专项“枣新品种选育和产业升级关键技术研究”(201004017)资助

2011-0-，改回日期:2011-0-