β-乳球蛋白包埋花色苷C3G对其抗氧化活性的保护*

杜文凯，蔡烈伟，李博，金建昌，杜琪珍

1(浙江工商大学食品化学研究所，浙江 杭州，310012)

2(漳州科技职业学院，福建 漳州，363202)

β-乳球蛋白包埋花色苷C3G对其抗氧化活性的保护*

杜文凯1，蔡烈伟2，李博1，金建昌1，杜琪珍1

1(浙江工商大学食品化学研究所，浙江 杭州，310012)

2(漳州科技职业学院，福建 漳州，363202)

利用热激的β-乳球蛋白(β-Lg)与矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)共组装形成纳米粒以保护C3G的抗氧化活性。溶液pH值为2.5～6.5、蛋白热激温度为30～85℃及β-Lg与C3G不同摩尔比例(1∶2～1∶32)对纳米体系的粒径、Zeta电位、包埋率及单位蛋白载药量具有显著影响。在pH 6.5时能够形成稳定的纳米分散体，在热激温度85℃、β-Lg与C3G摩尔比为1∶2时，β-Lg对C3G的抗氧化活性具有最好的保护作用。

纳米粒，β-乳球蛋白，矢车菊素-3-葡萄糖苷，抗氧化活性

矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)是目前研究最为广泛的花色苷单体之一，存在于黑米、越橘、桑葚等植物中，具有抗氧化、抗癌、抗炎症、抗心血管疾病、抗过敏、减肥等多种生物功能[1-3］。然而花色苷易受光、温度、pH、氧等外界因素的影响而发生变化[4］。其次由于其在肠胃停留时间有限、渗透性不足以及受pH、酶等影响[5-6］，口服生物利用度低。因此，花色苷在普通和保健食品等领域的应用有较大的局限性。

纳米粒子是粒径介于1～100 nm的材料，具有独特的表面效应和量子尺寸效应[7］。纳米技术在医药学和食品科学领域具有广阔的应用前景。通过将功能因子包裹于纳米粒子内部或吸附于纳米粒子表面，能够提高生物活性成分的稳定性，促使其活性的最大发挥。

目前关于花色苷的包埋主要采用微胶囊，所制备颗粒均未达到纳米级[8-10］。本研究采用热诱导的β-LG与C3G共组装制备β-LG-C3G的纳米分散体，并研究了β-LG-C3G纳米分散体对C3G抗氧化活性的保护作用。研究结果对于花色苷在食品饮料、保健品等领域的应用具有重要意义。

1 材料与仪器设备

1.1 实验材料

矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)由本实验室自黑米提取物中分离制备，纯度为94.4%[11］;β-乳球蛋白(β-Lg)(纯度＞90%)购自Sigma公司;色谱纯甲醇、乙腈购自天津四友精细化学品有限公司;其它试剂均为分析纯，购自华东医药股份有限公司;MILIPORE超滤浓缩离心管(3000MWCO)购自上海欧韦达仪器科技有限公司;实验用水均为超纯水。

1.2 仪器设备

TS-100B恒温摇床，上海善志仪器设备有限公司;AY-120电子天平，日本SHIMADZU;超高压液相色谱;UPLC，美国WATERS公司;JB-3涡旋仪，上海雷磁新泾仪器有限公司;VIS-723G紫外可见分光光度计，上海之信仪器有限公司;Nano-ZS型粒度仪，英国Malvern公司。

2 实验方法

2.1 β-LG–C3G纳米分散体系的制备

参照Shpigelman等的方法[8］并略做改进。配置pH 6.0～7.0的30 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(Na2HPO4-NaH2PO4)，并用磷酸调节pH 6.0的 缓冲液至pH 2.5～5.5备用。β-Lg溶于含有0.02%NaN3的(PBS)溶液中，室温下于200 r/min振荡12 h使其充分溶解。C3G溶于30 mmoL、pH2.5的磷酸缓冲液，现配现用。β-Lg溶液(1.9 mL)在不同温度下水浴热激20 min，加入0.1 mL C3G溶液，快速涡旋混合20 s，并迅速置于25℃的水浴中冷却。β-Lg终浓度为5.0 mg/mL(0.27 mmoL)。

本研究考察下述3个制备因素对β-LG–C3G纳米粒的影响:(1)β-Lg溶液的pH值(pH 2.5，4.5，5.5，6.5);(2)β-Lg 溶液热激温度(30℃，55℃，70℃ ，85℃);(3)β-Lg与 C3G的摩尔比例(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32)。

2.2 粒径及Zeta电位测定

溶液中颗粒的粒径和Zeta电位采用英国Malvern公司的Nano-ZS型粒度仪进行测定，散射角为173°，测试温度为25℃。

2.3 包埋率的测定

取2 mL β-LG-C3G溶液于超滤浓缩离心管，4℃条件下4000 g离心30 min，收集离心后的液体，超高效液相色谱(UPLC)定量检测超滤离心液中游离C3G的含量。UPLC检测条件为:流动相，A相:V(无水甲酸)∶V(水)=8.5∶91.5，B 相:V(无水甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=8.5∶25∶25∶91.5;B 相梯度洗脱条件:0～10 min，6%～30%;10～12 min，30%～6%;12～15 min，6%。色谱柱为BEH-C18柱(1.7 μm，50 mm×2.1 mm)。检测波长 280 nm，流速0.3 mL/min，进样量5μL。配置 31.25～500 μg/ml共5个浓度梯度C3G标准液，得标准曲线Y=2×10-8X+0.0105(R2=0.996)，其中 X 为峰面积，Y 为C3G 浓度(μg/mL)。

2.4 抗氧化活性测定

抗氧化活性采用FRAP法测定[12］。取0.1 mL待测溶液加入到2.9 mL FRAP反应液(由300 mmol/L pH 3.6的醋酸盐缓冲液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1的比例混合而成，现用现配)混匀后于37℃水浴孵育30 min，在593 nm处测定吸光值。

使用pH 2.5缓冲液配置20 mmol/L C3G溶液用于纳米粒制备，制备方法同2.1。β-LG-C3G溶液置于30℃环境中，采用2只紫外灯(30 W/只)持续照射加速花色苷降解，每隔24 h取样进行FRAP测定。

2.5 统计分析

本研究所有样品重复测定3次。两组样品间的差异显著性分析采用 Student’s t检验，组间多重比较采用 LSD检验。所有分析使用统计软件 SAS V8进行。

3 结果与分析

3.1 溶液pH值对β-LG-C3G纳米体系的影响

pH值(2.5～6.5)对β-LG-C3G纳米粒粒径、Zeta电位、包埋率和单位蛋白载药量的影响如表1所示。β-LG-C3G纳米粒和纯β-LG溶液在pH 4.5时出现混浊现象，平均粒径均达几百纳米;而在其它pH条件下澄清，粒径小于20 nm。pH 6.5的粒径大约为pH 2.5时的 1.5～2倍。当加热至 70～80℃，pH 2.5和中性条件下的β-LG发生聚集形成可溶的多聚体，而在等电点附近(pH 5.1)会形成肉眼可见的蛋白沉淀[13-14］。本研究结果与这些报道相一致。

Zeta电位是反应纳米体系稳定性的一个重要指标，高Zeta电位使小颗粒间斥力增加，不易聚集，从而更有利于稳定性。通常认为，稳定体系纳米粒Zeta电位应大于 +30 mV或小于-30 mV[15］。β-LG–C3G和β-LG纳米粒的Zeta电位均随着pH值的升高向负值转变，在 pH 6.5时 达到最大值，表明此时纳米体系最为稳定(表1)。

C3G包埋率和单位蛋白装载量随着pH的升高而增大，在pH 6.5时分别达到79.7% 和86.1 nmol/mg(表1)。这是因为在酸性条件下，β-Lg呈现闭合构象，疏水结构藏于蛋白内部，无法和小分子接触;而在中性条件下，蛋白内部的疏水结构域暴露，从而与配体小分子结合力增强[16］。

综合上述结果，β-LG-C3G在近中性条件下制备能够达到较好的澄清度、稳定性和较高的包埋率。花色苷通常在酸性条件下稳定，而在中性和碱性条件下容易降解[4］。研究结果表明，β-LG-C3G纳米粒可用于一些近中性的食品饮料中。

表1 pH值对β-LG-C3G颗粒粒径、Zeta电位、C3G包埋率和装载量的影响(热激温度70℃，β-LG与C3G摩尔比1∶2)

3.2 热激温度对β-LG-C3G纳米体系的影响

蛋白热激温度(30～85℃)对β-LG-C3G纳米粒粒径、Zeta电位、包埋率和单位蛋白载药量的影响如表2所示。随着热激温度的升高，纳米粒粒径、负Zeta电位值、C3G包埋率和单位蛋白装载量均增加。表明在测试范围内较高的热激温度更有利于β-LGC3G纳米粒的形成。中性条件下的β-LG在加热到70℃以上时，二聚体解聚成单体，原本位于蛋白内部的巯基和二硫键暴露，单体蛋白之间通过这些基团发生连接聚集;温度越高，这种效应越显著[17］，从而导致颗粒粒径随热激温度升高而增加。

表2 热激温度对β-LG-C3G颗粒粒径、Zeta电位、C3G包埋率和装载量的影响(pH 6.5，β-LG与C3G 摩尔比 1∶2)

3.3 β-Lg与C3G摩尔比例对β-LG-C3G纳米体系的影响

β-Lg与 C3G 摩尔比例(1∶2～1∶32)对 β-LGC3G纳米粒粒径、Zeta电位、包埋率和单位蛋白载药量的影响如表3所示，随着C3G对β-Lg的摩尔比例升高，粒径、负Zeta电位值和单位蛋白载药量都出现明显升高，而包埋率却依次下降。多酚类物质在低浓度时与蛋白形成可溶复合体，而在高浓度时能够使蛋白发生聚集甚至沉淀。在中性条件下多酚类物质的羟基发生质子化，使氧原子带负电荷，因此结合的C3G越多，纳米粒上的负电荷就越多[18］。

表3 摩尔比例对β-LG-C3G颗粒粒径、Zeta电位、C3G包埋率和装载量的影响(热激温度70℃ ，pH 6.5)

3.4 β-LG-C3G纳米粒的抗氧化活性

图1 不同热激温度对β-LG-C3G纳米粒的抗氧化活性保护作用的影响(pH 6.5，β-LG与C3G摩尔比1∶2)

热激温度(30～85℃)对β-LG-C3G抗氧化活性的保护作用如图1所示，随着时间的延续，相对于自由C3G，各热激温度下的β-LG-C3G抗氧化活性的降低趋势均有所减缓，热激温度越高，这种保护作用越明显。

β-LG与 C3G 摩尔比例(1∶2～1∶32)对 β-LGC3G抗氧化活性的保护作用如图2所示，β-LG相对于C3G的比例越高，对其抗氧化活性的保护作用越明显，在摩尔比例为1∶16和1∶32时，保护作用已经不明显。

4 结论

图2 不同摩尔比例对β-LG-C3G纳米粒的抗氧化活性保护作用的影响(热激温度85℃ ，pH 6.5)

溶液pH值、蛋白热激温度以及 β-Lg与C3G的摩尔比例对β-Lg-C3G纳米体系的粒径、Zeta电位、包埋率及单位蛋白载药量都有显著影响。当pH值为6.5、热激温度为85℃、β-Lg与C3G的摩尔比为1∶2时，β-Lg和C3G能够形成稳定的纳米分散体。研究表明β-Lg可作为纳米材料保护C3G稳定性和抗氧化活性，对C3G及其它花色苷在食品饮料等领域的应用具有重要意义。

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ABSTRACTCyanidin-3-glucoside(C3G)was coated by heat treatment with β-lactoglobulin(β-Lg)for the preservation of antioxidant activity.The effects of pH(2.5-6.5)，heating temperature of β-Lg(30-85 ℃)and the molar ratio of β-Lg to C3G(1∶2-1∶32)on the properties of β-Lg-C3G complexes were studied.All three factors significantly influenced the particle size，zeta-potential，entrapment efficiency of C3G and C3G encapsulation with β-Lg particles.Stable and clear solution could be obtained at pH 6.5.The highest protection of EGCG antioxidant activity was obtained with β-Lg heated at 85 ℃ and the molar ratio of 1∶2(β-Lg∶C3G).

Key wordsnanoparticle，β-lactoglobulin，cyanidin-3-glucoside(C3G)，antioxidant activity

Preservation of Cyanidin-3-glucoside Antioxidant Properties by Coating with β-lactoglobulin Nanoparticles

Du Wen-kai1，Cai Lie-wei2，Li Bo1，Jin Jian-chang1，Du Qi-zhen1
1(The Institute of Food and Chemistry，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310012，China)
2(Zhangzhou College of Science and Technology，Zhangzhou 363202，China)

硕士研究生(杜琪珍教授为通讯作者，E-mail:qizhendu@163.com)。

*教育部博士点基金项目(0113326110001)，浙江省自然科学基金重点项目(Z12C160014)，国家科技支撑计划课题(2011BAD01B03-5)

2012-03-26，改回日期:2012-04-28