嗜热碱性果胶酶产生菌的筛选及产酶条件优化*

王步江，姜丹，涂然

1(天津农学院食品科学系，天津，300384)

2(天津大学化工学院，天津，300072)

3(中国科学院天津工业生物技术研究所，天津，300308)

嗜热碱性果胶酶产生菌的筛选及产酶条件优化*

王步江1，姜丹2，涂然3

1(天津农学院食品科学系，天津，300384)

2(天津大学化工学院，天津，300072)

3(中国科学院天津工业生物技术研究所，天津，300308)

从极端土壤中分离到1株高效产碱性果胶酶菌株RH214，经鉴定为Bacillus smithii。为了进一步提高其产果胶酶活性，对产酶的培养基成分进行了优化。首先采用单因素试验筛选出最佳碳源为可溶性淀粉，最佳氮源为蛋白胨，金属盐为KH2PO4。根据单因素结果确定可溶性淀粉浓度、蛋白胨浓度和KH2PO4浓度为主因素，利用Box-Behnken试验设计和响应面法分析确定各因素的最优水平，得出菌株RH214的最优产酶条件:可溶性淀粉的浓度为85.6 g/L、蛋白胨浓度11.8 g/L、KH2PO4浓度为3.8 g/L、酵母粉1 g/L、FeSO41g/L、KCl 0.5 g/L、起始pH9.0、装液量80 mL/250 mL、温度40℃、摇床转速150 r/min，培养时间为16 h。在此条件下，进行验证实验，获得产酶活性为(88±0.86)U/mL，比未优化前的20.50 U/mL提高了4.3倍。

碱性果胶酶，Plackett-Burman设计，响应面，培养基

果胶酶是一类含有多种组分的可将果胶分解成半乳糖醛酸等物质的生物催化剂，是分解果胶质的多种复合酶类的统称[1］，通常包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酯酶(PE)、果胶裂解酶(PL)等主要组分。微生物因具有生长速度快、生长条件简单、代谢过程特殊和分布广等特点而成为实际生产中果胶酶的主要来源。果胶酶在生产上的应用已有50余年的历史，已被广泛应用于果汁、果酒的澄清，水果蔬菜的液化、浸解，浓缩咖啡和速溶茶的加工以及木材防腐，棉织物精炼加工等方面[2-3］。碱性果胶酶是非常重要的工业酶制剂之一，具有不可估量的潜在应用价值，其在棉麻织品生产工艺及某些蔬菜处理工艺中显示其独到的优势碱性果胶酶的研究可扩展果胶酶的应用范围[3］。目前国内果胶酶发酵的酶活力低，导致生产成本高，限制了该酶的广泛应用，本文针对从极端环境中分离出产果胶酶的地衣芽孢杆菌，并对产碱性果胶酶的培养基条件进行了优化，为进一步规模生产、分离纯化及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样

土样采自云南腾冲温泉附近，采样点温度50～80℃，pH 7～10。

1.1.2 主要试剂及仪器

主要试剂:3，5-二硝基水杨酸、果胶，半乳糖醛酸，蛋白胨、KH2PO4、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉等。

主要仪器:FA604A电子分析天平，上海精天电子仪器有限公司;DX-35BI电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2FD双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司;KYC-100C全温振荡器，上海福玛实验设备有限公司;752型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;TGL-16B台式离心机，上海安亭科学仪器厂

1.1.3 培养基

富集培养基:果胶10 g、KH2PO42 g、(NH4)2SO45g、FeSO41 g、KCl5g、CaCl22 g、MgSO43 g;水1000mL，培养 pH 9。

初筛培养基:果胶10 g、酵母粉1g、KH2PO42 g、(NH4)2SO45 g、FeSO41g、KCl5g、CaCl22 g、MgSO43 g、水1000mL，培养 pH 9。

产酶基础培养基:葡萄糖10 g、酵母粉1 g、FeSO41g 、KCl5g、水1000 mL，培养 pH 9。

1.2 方法

1.2.1 菌种筛选

10 g土壤置于40 mL生理盐水中，加玻璃珠打散。移取10～40 mL富集培养基，50℃培养2～3 d。富集培养液梯度稀释后，涂布到以果胶为唯一碳源的初筛平板上，50℃培养2～3 d。从初筛平板上挑取较大的菌落，划线分离后接种到平板中过夜培养，种子液接入产酶基础培养基中，40℃振荡培养，摇床转速150 r/min，装液量80 mL，16 h 后取样测酶活力[7］。

1.2.2 果胶酶活性测定

取一定稀释倍数的发酵液4000 r/min，0.5 mL于具塞试管中(以灭酶发酵液作为空白对照)加入2.0 mL4g/L标准果胶溶液(pH 10.0)，于50℃恒温水浴中反应30 min，按DNS法测定还原糖，752分光光度计530 nm处比色。半乳糖醛酸标准曲线参照文献[5］进行。酶活定义:在本实验条件下，以每分钟由底物产生1 μg半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活力单位(1 U=1 μg/min)。

1.2.3 菌种的鉴定

根据《伯杰细菌鉴定手册》，对筛选的菌体进行表型和生理生化实验鉴定。另外以嗜热菌的总基因组为模板，进行16S rDNA系列扩增。根据细菌16S rDNA保守序列设计的通用引物，引物序列为:16S-F:5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCA G-3’和 16 S-R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。通过 PCR扩增其16S rDNA编码基因。将扩增片段回收后测序，序列在 NCBI上检索比对[7］。

2 结果与分析

2.1 产碱性果胶酶菌株的筛选

通过多轮初筛和复筛，得到30株产果胶酶的细菌，接种到基础产酶培养基中培养，每隔6h测其酶活力，在培养至16 h时，其中的1株产酶量最高，酶活力可达到20.50 U/mL。命名为RH214。该菌落圆形，扁平，边缘整齐，白色粗糙，不透明，有淡淡的异味。通过生理生化特性及16S DNA序列分析，确定RH214 为 Bacillus smithii。

本实验对RH214果胶酶酶粗酶液作了初步的酶学性质研究，发现它在50℃时酶活性最高，70℃时酶活性也能达到最高值的80%，最适pH值为9.0。由此确定该菌产的碱性果胶酶是一种具有优良特性的果胶酶，以下实验通过优化培养基来提高其果胶酶的产量。

2.2 碳源

碳源在微生物生长和产酶过程中有重要的作用，为微生物的正常生长，分裂提供物质基础。地衣芽孢杆菌可利用多种碳源进行生长，考虑到果胶酶是诱导性酶类，培养基碳源采用含有果胶或一些可溶性糖类可能更有利于果胶酶的积累，将菌接种于含酵母粉1 g/L，添加100 g/L不同碳源的培养基中，培养16 h，测其酶活力。其结果见图1。

图1 不同种类的碳源对酶活力的影响

由图1可知，在碳源中大分子的糖类比单糖有利于酶活力的提高，可溶性淀粉最有利于果胶酶的产生，其酶活性最高，可达到65.46 U/mL。可能原因是可溶性淀粉本身就是大分子物质具有类似果胶的性质，可以起到诱导果胶酶的产生和积累。由此确定RH214菌株产果胶酶的最适碳源为可溶性淀粉，酶活性依次为麦芽糖、果糖、蔗糖、葡萄糖，木糖。

2.3 氮源

微生物的细胞由蛋白质、核酸、脂类和水组成，果胶酶本身又是蛋白质，而氮素则是组成蛋白质和核酸的主要元素。在酶制剂工业中，氮源是不可缺少的重要原料。向基础培养基中分别加入不同的有机和无机氮源进行试验。黄豆粉、玉米粉添加量为10 g/L，酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵添加量为5 g/L。

图2 不同种类的氮源对酶活力的影响

由图2可知，黄豆粉、玉米粉等粗放氮源对产酶的作用也较好，但有机氮源产酶比无机氮源要好，在基本培养基中添加蛋白胨可迅速提高酶活力，对果胶酶活力影响最大，主要是蛋白胨营养丰富，所以在后续的实验中采用蛋白胨作为培养基的氮源。大规模工业生产时考虑经济效益因素，可采用粗放氮源和无机氮源，这样产品成本较低，更有竞争力。

2.4 不同金属盐

无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物质，微生物在生长繁殖和代谢过程中，都需要无机盐离子，它们在机体中的生理功能主要是作为酶的活性中心的组成部分，维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。基础培养基中分别添加2 g/L的 NaCl、CaCl2、MgSO4、KH2PO4和FeSO4来确定不同无机盐离子对产酶的影响，如图3所示。与对照比较可发现，KH2PO4有利于果胶酶的产生和积累，FeSO4次之，NaCl、CaCl2、MgSO4对酶的作用不明显。

图3 不同种类的金属离子对酶活力的影响

2.5 Box-Behnken试验设计及结果

培养基中的营养物质的配比合适时，微生物才能产生较高的酶活性，而各个成分之间都存在着一定的交互作用，从单因素的结果发现可溶性淀粉、蛋白胨和KH2PO4对酶活力的提高作用明显。为了确定最优水平，利用响应面法对产酶活力的主效因子进一步优化。以酶活力为响应值，Design-Expert version 7.1.6 trial进行Box-Behnken试验设计来探究三者间的关系[8］。设计方案及结果见表1、表2。

表1 Box-Behnken试验因素水平表

表2 Box-Behnken试验设计及结果

续表2

利用Design Expert 7.1.6 trial软件对表2的数据进行二次多项回归拟合，获得产酶活力对可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4的二次多项回归方程:

表3 二次多项式模型方差分析

由表3可知，F值为31.66，复相关系数 R2=0.9760，表明97.6%的酶活力的变化可以有此模型解释，说明模型对实际情况拟合较好;模型的P值为0.0055说明该模型显著，可用来进行响应面预测。校正系数表明R2Adj=0.9452，表明94.52%试验数据的变异性可用此回归模型来解释。

表4 二次多项回归方程系数的显著性检验

表4可知，蛋白胨和KH2PO4对菌株产碱性果胶酶活力的线性效应显著，但可溶性淀粉浓度线性效应不显著;相比较而言，各因素的平方项效应极为极显著;各因素之间的交互作用显著。

2.6 响应面优化结果的分析

由二次回归方程所得到的响应面图及相应的等高线见图4～图6。各因素交互作用对响应值酶活力的影响由图可直观地反映出来。

图4 可溶性淀粉浓度和蛋白胨质量浓度对酶活力影响的响应面和等高线

由图4可看出，可溶性淀粉浓度和蛋白胨浓度交互作用显著，可溶性淀粉浓度变化对酶活力的影响没有蛋白胨明显。随着蛋白胨浓度的逐渐增加，碱性果胶酶活力也逐步增加。可溶性淀粉可作为细菌的一种较好的廉价碳源。

图5 可溶性淀粉浓度和KH2PO4浓度对酶活力影响的响应面和等高线

由图5可看出，可溶性淀粉和KH2PO4的浓度交互作用显著，随着KH2PO4浓度的降低，菌株产酶活力逐渐增大，可溶性淀粉浓度过高或者过低都会影响菌株产果胶酶的活力。KH2PO4浓度过高会抑制菌体的生长，不利于果胶酶的积累。

由图6可看出，蛋白胨和KH2PO4的浓度交互作用显著。随着KH2PO4的浓度降低和蛋白胨浓度的增高，菌株产果胶酶活性逐步增加。蛋白胨浓度继续升高时有利于果胶酶的积累。

图6 KH2PO4浓度和蛋白胨浓度对酶活力影响的响应面和等高线

通过对回归方程的进一步分析，确定Y的最大值为 88.19 U/mL，此时可溶性淀粉、蛋白胨和KH2PO43个因素的最优编码值为0.14，0.36，-0.1，实际对应的浓度为，85.6 g/L、11.8 g/L、3.8 g/L。为验证模型的准确性，在此条件下进行了3组实验，实测的果胶酶活力为(88±0.86)U/mL。这与模型预测值接近，说明该模型能较好地预测实际的产酶情况。

3 结论

本实验从极端环境中筛选得到了1株高产果胶酶的菌株C1，经鉴定为Bacillus smithii RH214，并对RH214菌株发酵产酶的条件进行了优化。首先确定最优碳、氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨，金属KH2PO4有利于碱性果胶酶的活性的提高。然后通过Box-Behnken试验设计和响应曲面分析法对RH214菌株产酶活性有显著影响的3个因素进行优化组合，最终获得最优产酶条件为:可溶性淀粉的质量为8.56 g/L、蛋白胨质量浓度1.18 g/L、KH2PO4质量浓度为0.38g/L、酵母粉1g/L、FeSO41 g/L、KCl5g/L、起始 pH9.0，装液量 80 mL/250 mL，温度40℃，摇床转速150 r/min，培养时间为16h。在此条件下，进行验证实验获得产酶活性为(88±0.86)U/mL，比未优化前的20.50 U/mL提高了4.37倍。

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ABSTRACTA stain RH214 with high ability to produce pectinase was isolated from soil and identified as Bacillus smithii.In order to improve the production of pectinase，some fermentation conditions were optimized.According to single-factor experiments，the optimal carbon source ，nitrogen source and salt were determined to be soluble starch，peptone，and KH2PO4respectively.As the key factors，these single factors(soluble starch，peptone and KH2PO4)were further optimized by Box-Behnken design and response surface methodology.A maximum pectinase activity of(88 ±0.86)U/mL was obtained using the condition as follows:after 16 h fermentation of 80 mL fermentation medium containing soluble starch 85.6 g/L，peptone 11.8 g/100 mL，KH2PO43.8 g/L and FeSO41 g/L，KCl 0.5 g/L at an initial pH of 9.0，fermentation temperat.ure 40℃ with 150 r/min shaking.Under these conditions，the activity production was 4.3 times higher than the initial production(20.50 U/mL)before optimization.

Key wordspectinase，Plackett-Burman design，response surface methodology，fermentation optimization

Screening and Optimization of Bacillus smithii RH214 for Pectinase Activity

Wang Bu-jiang1，Jiang Dan2，Tu Ran3
1(Department of Food Science，Tianjin Agriculture College，Tianjin 300384，China)
2(School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China)
3(Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

硕士，讲师。

*天津市科学技术委员会工业生物专项“工业酶关键技术研究”(10ZCZDSY06900)

2012-01-10，改回日期:2012-03-02