反相高效液相色谱法测定苹果酸发酵液中的有机酸

黄慧敏，张伟国

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

反相高效液相色谱法测定苹果酸发酵液中的有机酸

黄慧敏，张伟国

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

采用反相高效液相色谱法分析测定苹果酸发酵液中的有机酸，最终确定了适用于发酵液中各种有机酸含量测定的色谱条件，色谱柱:COSMOSIL 5C18-PAQ(4.6 mm I.D.×250 mm);紫外检测波长:210 nm;流动相:1%乙腈-20 mmol/L KH2PO4溶液(pH 2.8);流速:0.5 mL/min;柱温:23℃。结果表明，在该条件下苹果酸发酵液中的7种有机酸都得到了较好分离，方法的回收率为94.2%～102.7%，表明具有较好的准确度和精密度。

反相高效液相色谱法，苹果酸发酵液，有机酸

L-苹果酸是一种重要的天然有机酸，其口感接近天然苹果的酸味，在国外是用量很大的一种酸味剂。在食品、医药、印染及化工等方面都有广泛的用途，已成为继柠檬酸、乳酸之后用量排第3位的食品酸味剂，是一种很有发展前途的有机酸新产品[1］。

直接发酵法是生产苹果酸的较有竞争力的方法[12-21］，如何快速准确地测定发酵液中的 L-苹果酸则是发酵过程中首先需要解决的问题。有机酸的定量测定方法有许多种[6-11］，而定量分析发酵液中苹果酸的方法[2］主要有2，7-萘二酚法和反相高效液相色谱法[3-5，8-9］。由于苹果酸发酵液成分复杂，包括残糖、菌体、蛋白和各种有机酸等物质，在采用2，7-萘二酚法测定苹果酸含量时需要使用浓硫酸，而浓硫酸具有强氧化性，可将许多物质氧化包括发酵液中的物质和试管中的残留杂质，从而对测定结果的准确性产生强烈的干扰;而反相高效液相色谱法操作简便，准确度高，重现性好，可同时定量多种有机酸，因此已获得广泛的应用[11，22-25］。本研究选用日本的 COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱，在磷酸盐缓冲液中添加适量的乙腈，利用反相高效液相色谱法对苹果酸发酵液中有机酸进行定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:DIONEX高效液相色谱仪(DIONEX P-680泵、ASI-100自动进样器、TCC-100柱温箱)(美国DIONEX公司)。

试剂:草酸、苹果酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酸、KH2PO4、H3PO4等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;水为超纯水;乙腈为色谱纯，购自江苏汉邦科技有限公司;流动相、对照品和样品溶液使用前均经0.45 μm的滤膜过滤。

1.2 色谱条件

色谱柱:COSMOSIL 5C18-PAQ(4.6 mm I.D.×250 mm)(日本半井公司);流动相:1%乙腈-20 mmol/L KH2PO4溶液(pH 2.8);流速:0.5 mL/min;进样量:10 μL;柱温:23℃;紫外检测波长:210 nm。

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 混合标准溶液的配制

准确称取草酸16.5 mg、苹果酸48.3 mg、柠檬酸65.3 mg、丁二酸 91.6 mg、富马酸 2.4 mg、α-酮戊二酸20.3 mg、丙酮酸25.7 mg，用超纯水溶解并定容至100 mL配制成有机酸标准混合溶液。

1.3.2 有机酸系列标准品溶液的配制

分别称取柠檬酸500 mg、草酸50 mg、丁二酸500 mg、苹果酸50 mg、富马酸50 mg、丙酮酸100 mg、α-酮戊二酸100 mg，用超纯水溶解并定容至100 mL，各有机酸的浓度分别为:柠檬酸5.0 g/L、草酸0.5 g/L、丁二酸5.0 g/L、苹果酸0.5 g/L、富马酸0.5 g/L、丙酮酸1.0 g/L、α-酮戊二酸1.0 g/L。分别取上述各标准溶液 10、20、30、40、50 mL 于 50 mL 的容量瓶中用超纯水稀释至刻度，即得各种有机酸的标准品溶液。即柠檬酸的浓度分别为:1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L;草酸的浓度分别为:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L;丁二酸的浓度分别为:1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L;苹果酸的浓度分别为:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L;富马酸的浓度分别为:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L;丙酮酸的浓度分别为:0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L;α-酮戊二酸的浓度分别为:0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L。

1.4 样品液的处理

取不同发酵周期的苹果酸发酵液，离心(8000 r/min，10 min)去除菌体和CaCO3，然后取上清液加入稀H2SO4酸解充分后，使有机酸游离出来，再离心去除CaSO4，进样前分别使用0.45 μm滤膜过滤处理即得待测液。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

在200～400 nm的波长范围内对草酸、苹果酸、丙酮酸、酮戊二酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸进行紫外波长扫描，结果(图1)表明，7种有机酸在210 nm附近均有较强吸收，所以选择在210 nm处检测有机酸。

图1 7种有机酸的紫外扫描图

2.2 混合流动相组成的确定

若流动相只是磷酸盐溶液，发酵液中的有机酸分离效果较差，且分析时间长达30 min。在流动相中加入少量乙腈能够明显缩短各种有机酸的保留时间且改善峰形。所以本实验考察了在流动相中添加不同浓度的乙腈对有机酸分离度的影响，实验结果表明，适当增加乙腈的浓度有利于有机酸的分离，当乙腈在流动相中的浓度增加时，各种有机酸的保留时间降低，峰形渐好，但是乙腈的浓度较大，会导致苹果酸与α-酮戊二酸分离效果较差。经多次试验，发现当乙腈在流动相中的浓度为1%时，各种有机酸的分离效果、峰形较好且保留时间较短。

2.3 流动相pH值的确定

将流动相的pH值用磷酸分别调至2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0，分析不同的 pH 值对各种有机酸的分离效果的影响。结果表明，流动相pH的变化对有机酸的分离效果影响很大。当pH值为2.0时，柠檬酸与丁二酸分离效果较差，随着pH值的升高，柠檬酸与丁二酸逐渐分开，到pH值为2.6时二者完全分开，之后二者的分离度增大;当pH值为2.8时，各种有机酸能够得到较好的分离;当pH值为3.0时苹果酸与丙酮酸的分离度减少。所以选定流动相的最佳pH值为2.8。

2.4 流动相磷酸盐浓度的选择

将流动相中的磷酸二氢钾-磷酸溶液(pH 2.8)的浓度分别配制成 0、10、20、50、80 mmol/L，考察对各种有机酸的分离效果的影响。结果表明，在不同的KH2PO4浓度下各有机酸的出峰时间及出峰顺序均无较大差异，但当流动相中不含有磷酸盐时，各有机酸分离效果不好;逐渐增加流动相中磷酸盐的浓度，各种有机酸均能得到有效分离，且不影响分离效果。但是由于较高浓度的盐会对柱子和泵的使用寿命产生影响，所以本实验选用20 mmol/L的KH2PO4溶液作为流动相。

2.5 柱温、流动相流速的选择

在色谱柱温度分别为 28、25、23、20℃时，考察各种有机酸的分离效果。由结果可知，温度越高，传质过程越快，有机酸保留时间越小，分离度降低，且丙酮酸与苹果酸不能有效地分离;当温度逐渐降低，丙酮酸与苹果酸逐渐开始分离;当温度为20℃时，有机酸的保留时间较长;当温度为23℃时各种有机酸的分离效果较好，所以选择柱温为23℃。经过考察不同流动相流速对有机酸分离效果的影响可知:流动相流速太快，各种有机酸的峰分离效果不好，流速太慢，峰的保留时间太长，并且影响峰的形态。当流动相流速为0.5 mL/min时可达到快速分离而不影响柱效，所以确定流速为0.5mL/min。

2.6 标准曲线及检出限

将7种有机酸的标准品溶液在2.2的色谱条件下进行HPLC分析，平行测定6次，得到各种有机酸的线性回归曲线方程、相关系数，以3倍信噪比(S/N)计算最小检出限量，结果见表1。

表1 七种有机酸标样的线性回归方程及检出限

2.7 液相色谱图

以最优色谱分离条件对有机酸标准混合样品和苹果酸发酵液进行HPLC分析，图2、图3分别为有机酸标样和苹果酸发酵液样品的色谱图。

图2 有机酸标准混合溶液的色谱图

图3 苹果酸发酵液的色谱图

2.8 发酵液中有机酸的成分分析

在1.2所述的色谱条件下对不同时期的苹果酸发酵液进行HPLC分析，进样量为10μL，确定发酵液中除了苹果酸外，还有草酸等副产物，检测结果经过表1所示的线性回归方程分析，得出各有机酸的含量变化如表2所示。

表2 不同发酵时间苹果酸发酵液中有机酸含量测定结果

2.9 回收率实验

取苹果酸的发酵液3份，分别加入一定量的有机酸标准混合溶液，平行测定3次，经0.45 μm滤膜过滤后，按1.2的色谱方法测定样品的回收率，结果见表3，从分析结果可知7种有机酸的加标回收率为94.2%～102.7%。表明该方法的准确性好。

表3 发酵液中各种有机酸的回收率实验结果

2.10 精密度实验

取处理好的苹果酸发酵液样品在1.2的条件下进行6次平行测定，考察方法的精密度。结果如表4所示，由于精密度RSD＜5%，表明该方法有较好的重现性。

表4 发酵液中各种有机酸的精密度实验结果 g/L

2.11 稳定性试验

在室温和-4℃冰箱中放置一定的时间，分别取样测得发酵液中各种有机酸的含量，发现各有机酸的浓度在24 h内基本不变，结果表明苹果酸发酵液在24 h内是稳定的。

3 结论

适用于发酵液中各种有机酸含量测定的检测条件为:使用 COSMOSIL 5C18-PAQ(4.6 mm I.D.×250 mm)色谱柱;紫外检测波长为210 nm;采用1%乙腈-20 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH 2.8)作为流动相;流速:0.5 mL/min;进样量:10 μL;柱温:23℃。在该条件下苹果酸发酵液中的7种有机酸都得到了较好的分离且回收率高，重现性较好。

[1]刘建军，姜鲁燕，赵祥颖，等.苹果酸的应用及研究进展[J］.中国食品添加剂，2003(3):53-56.

[2]尹志梅，杨清，吴秀敏，等.L-苹果酸定量检测方法[J］.中国酿造，1999(4):33-34.

[3]黄桂颖，白卫东，杨幼慧，等.反相高效液相色谱法测定荔枝肉中 10种有机酸[J］.现代食品科技，2009，25(5):568-570.

[4]高海燕，廖小军，王善广，等.反相高效液相色谱法测定果汁中11种有机酸条件的优化[J］.分析化学，2004，32(12):1645-1648.

[5]林维宜，房学军，杨红，等.高效液相色谱法测定山楂中有机酸研究[J］.大连轻工业学院学报，1992，11(3/4):21-24.

[6]崔雨林，戴蕴青，韩雅珊.高效液相色谱法测定水果及果汁中的有机酸[J］.北京农业大学学报，1995，21(1):39-43.

[7]丁明玉，陈培榕，罗国安.食品中有机酸的高效液相色谱分析法[J］.色谱，1997，15(3):212-215.

[8]高海燕，王善广，胡小松，等.利用反相高效液相色谱法测定梨汁中有机酸的种类和含量[J］.食品与发酵工业，2004，30(8):96-100.

[9]宋永康，韩嘉，潘葳，等.影响测定反相高效液相色谱流动相pH值的因素[J］.现代科学仪器，2005(1):95-97.

[10]文姝，刘欣，袁杰利，等乳杆菌、双歧杆菌代谢产物的气相色谱分析[J］.中国微生态学杂志，2004(16):221-222.

[11]李友元，陈长华，陶萍.高效液相色谱法测定螺旋霉素发酵液中的有机酸[J］.色谱，2002，20(1):46-48.

[12]Hong SH，Lee SY.Metabolic flux analysis for Succinic acid production by recombinant Escherichia coli with amplified malic enzyme acitivity[J］.Biotechnology and Bioengineering，2001，74(2):89-95.

[13]Soo Yun Moon，Soon Ho Hong，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of malic acid[J］.Biochemical Engineering Journal，2008，40(2):312-320.

[14]胡纯铿.L-苹果酸产生菌黄曲霉H298发酵特性的研究[J］.食品与发酵工业，1999，25(2):19-22.

[15］ 金其荣，张继民，徐勤.有机酸发酵工艺学[M］.北京:中国轻工业出版社，1989:339-406.

[16]周小燕，吴清平，蔡芷荷，等.曲霉N1-14'胞质酶活性与产L-苹果酸能力的关系[J］.微生物学报，2000，40(5):500-505.

[17]Ok Taing，Kazuya.Taing.Production of malic and succinic acids by sugar-tolerant yeast Zygosaccharomyces rouxii[J］.Eur Food Res Technol，2007，224(3):343-347.

[18]Roa Engel C A，Straathof A J，Zijlmans T W，et al.Fumar-ic Acid Production by Fermentation[J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，78(3):379-389.

[19]Battat E，Peleg Y，Bercovitz A，et al.Optimization of L-malic acid production by Aspergillus flavus in a stirred fermentor[J］.Biotechnology and Bioengineering，1991，37(11):1108-1116.

[20]吴清平，周小燕，钟瑜，等.L-苹果酸产生菌的筛选及高产突变株诱变选育[J］.真菌学报，1993，12(4):304-312.

[21]刘宁，李霜，何皓，等.少根根霉利用木糖和葡萄糖分步发酵制备富马酸[J］.过程工程学报，2008，8(4):716-719.

[22]Omole O O，Brocks D R，Nappert G，et al.High-performance liquid chromatographic assay of L-lactic acid and its enantiomers in calf serum[J］.Journal of Chromatograph B，1999，727(1):23-29.

[23]白冬梅，杜国民，赵学明，等.反相高效液相色谱法测定产琥珀酸放线杆菌发酵液中的有机酸[J］.分析化学，2003，3l(12):1496-1499.

[24]钱兵，章燕，李莎，等.反相高效液相色谱法测定丙酸发酵液中的有机酸[J］.分析化学，2007，35(11):1651-1653.

[25]史春云，田晶，马延和，等.反相高效液相色谱法测定嗜碱微生物发酵液中有机酸[J］.食品与发酵工业，2007，33(4):116-118.

ABSTRACTReversed phase HPLC method was applied to determine organic acid in malic acid fermentation liquor in this paper.The chromatographic conditions are finally conformed to apply to all kinds of organic acid content determination in the fermentation.The conditions are as follows:COSMOSIL 5C18-PAQ column(4.6 mm I.D.×250 mm)was used at 23℃.UV detection wavelength was 210 nm.Solution containing 1%acetonitrile and 20mmol/L KH2PO4at pH 2.8 was used as mobile phase with flow rate of 0.5 mL/min.The seven organic acids in malic acid fermentation liquor were preferably separated under these conditions.The recovery ratio was 94.2%～102.7%and the method had good accuracy and precision.

Key wordsreversed phase HPLC，malic acid fermentation liquor，organic acids

Determination of Organic Acids in Malic Acid Fermentation Liquor by Reversed Phase HPLC Method

Huang Hui-min，Zhang Wei-guo
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

硕士研究生。

2012-01-17，改回日期:2012-04-09