采用催化自溶和生物破壁技术提取啤酒酵母细胞壁多糖

段胜林，王雪，苑鹏，刘炎桥，刘杰，刘士伟

(中国食品发酵工业研究院，北京，100027)

采用催化自溶和生物破壁技术提取啤酒酵母细胞壁多糖

段胜林，王雪，苑鹏，刘炎桥，刘杰，刘士伟

(中国食品发酵工业研究院，北京，100027)

以废弃啤酒酵母为原料采用催化自溶与生物破壁技术生产细胞壁多糖。经过单因素试验后确定了酵母自溶的适宜条件:50～60℃，pH 5.0～6.0，食盐浓度0.8%，VB2浓度 200 mg/L，料液比(g∶mL)1∶8～10，剪切微化处理约9 h以上。此外，确定了采用60℃下，1∶10的料液比，0.02%～0.03%的蛋白酶添加量和2%的NaOH浓度为细胞壁多糖的适宜提取条件。此方法得到的细胞壁多糖中甘露聚糖的含量＞22%，葡聚糖的含量＞35%。同时发现使用酪蛋白钠和改性淀粉作为酵母提取物的微胶囊化材料时，产品喷雾效果好，且不吸潮。

废弃啤酒酵母，催化自溶，细胞壁多糖，功能食品

啤酒废弃酵母的排放量是啤酒产量的2%，我国啤酒废弃酵母的排放量高达30万t/年[1］。啤酒废酵母中含有48%～55%的蛋白质、23%～28%的碳水化合物，6%～8%的核糖，微量VB2和谷胱苷肽以及丰富的氨基酸和多种矿物质等[2］。如果这些啤酒废酵母随废水排放，不仅没有得到利用，反而造成严重的环境污染[3］。目前，国内对酵母提取物(酵母精)的研究与生产比较多，但对酵母壁多糖的综合利用研究较少[4］。

啤酒酵母细胞壁中含有大量的多糖，约为酵母细胞干重的40%。其外侧部分是含甘露糖的多糖体，内侧部分是葡聚糖[5］。这2种糖在人体消化道中稳定性好，活性高，具有一定的免疫调节功能，如对沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肉毒梭状芽孢杆菌和肉毒梭状芽孢杆菌等有很好的抑制作用，对双歧杆菌、干皓乳杆菌、嗜酸乳杆菌和德尔布吕克乳杆菌等益生菌有明显促进繁殖的作用[6］。此外，酵母细胞壁多糖对沙门氏肠炎杆菌、摩氏变形菌、柠檬酸杆菌具有100%的截取作用;其通过物理吸附或直接结合霉菌毒素而不影响其他成分，对黄曲霉菌素、玉米赤霉烯酮和猪曲霉毒素的结合率分别为82.5%、51.6%和26.4%，效果显著;加之细胞壁多糖天然、安全、可靠，因此成为抗生素替代品的开发热点[7］。

在食品工业中，酵母细胞壁多糖能充当乳化剂、增稠剂、低热食品原料等角色，另外作为一种高效免疫因子，它可直接食用[8］。据报道，由于酵母细胞壁多糖的分子结构特殊性，它能有效激活人体免疫应答系统，识别病毒并杀灭病毒;同时，当人体在受到外界环境巨大变化时，酵母细胞壁多糖能够提高人体的应激能力，防止传染性疾病的发生[9］。

由于酵母细胞中的蛋白质和脂类等物质与细胞壁多糖以络合物的形式存在，因此需要对细胞壁多糖进行分离、提取后再利用。目前主要有碱法、高压均质法、酶法来提取酵母细胞壁多糖[10］。本研究采用催化自溶与生物破壁技术的方法生产细胞壁多糖，显著减少了酵母细胞的自溶时间，有效保护了甘露聚糖和葡聚糖的天然结构，同时采用膜分离技术分离提纯，实现了清洁生产。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

啤酒废酵母泥，取自北京燕京啤酒股份有限公司。

碱性蛋白酶、NaOH、NaCl、HCl、乙醇、淀粉、VB2、明胶、阿拉伯胶、酪蛋白钠、甲基纤维素、聚乙二醇、葡聚糖、甘露聚糖等，均为分析纯。

1.2 实验仪器

离心机(Avanti J25)，美国BECKMAN公司;喷雾器(20L 8AH)，山东沂星植保机械厂;烘干箱(DGG-9036A)，上海林频环境设备厂;pH计(HANNA 30100-0165)，上海艾测科技有限公司;紫外分光光度计(SPECORD 200)，德国耶拿公司;高效液相色谱仪(Agilent 1200)，安捷伦科技有限公司;双酚A聚砜中空纤维膜(MAX-UF-110×900)，杭州泓泉膜技术有限公司;大型超滤装置(CLQ-125)，无锡昌林自动化科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 啤酒废弃酵母细胞壁多糖提取分离的工艺

1.3.2 啤酒废弃酵母的预处理

废弃啤酒酵母分为干基啤酒酵母和湿基啤酒酵母。不同啤酒生产企业的废弃啤酒酵母随种龄、营养条件差异而不同，主要表现为自身酶活力的差异。本实验选用的是低温干燥(50～70℃)的干基啤酒酵母。干基啤酒酵母先用清水清洗，再用筛网过滤，然后用离心机脱水，以除去酒类干物质和干燥时带来的异物。

1.3.3 啤酒废弃酵母自溶的影响因素

酵母的提取方法有多种，包括酶法、酸法和自溶等，从环保和生产可行性上考虑，通常选用自溶方式提取酵母提取物，但自溶方式时间较长，影响生产效率，实验发现添加自溶促进剂(食盐和VB2)可催化自溶，显著缩短自溶时间。本实验通过设计单因素实验，研究了温度、时间、pH值、食盐和VB2、剪切微化、料液比共7个因素各自对废弃啤酒酵母的自溶影响程度，并确定干基啤酒酵母的适宜自溶条件。

1.3.4 酵母提取物的微胶囊化

酵母提取物非常容易吸潮，不容易粉末化，采用微胶囊包埋技术可以解决其粉末化问题，微胶囊包埋方法很多，包括喷雾干燥法、相分离法、包结络合法、空气悬浮法和界面聚合法等。本实验选用喷雾干燥法使酵母提取物粉末化，使用喷雾干燥微胶囊包埋的关键是囊壁材料的选择，根据酵母提取物的成分以及工业生产的可行性，选用明胶和阿拉伯胶、改性淀粉、酪蛋白钠、酪蛋白钠和改性淀粉、聚乙二醇、甲基纤维素作为囊壁实验材料，通过制成品的吸潮程度和喷雾效果来判定囊壁材料的类型。

1.3.5 酵母细胞壁的生物破壁技术方法优化

破碎细胞壁结构的方法有:有机溶剂法、超微粉碎法、微波法与生物发酵法等。本实验采用生物发酵法，该法具有酵母细胞破碎完全、使用方便、设备简单以及安全无残留等特点。本实验研究了不同酶制剂对酵母细胞壁的破壁效果以及蛋白酶对酵母细胞壁多糖提取效率的影响，同时研究了温度、破碎时间、pH值、料液比对提取率的影响，并确定适宜工艺参数。

1.3.6 酵母细胞壁多糖提取液的超滤处理

酵母细胞壁多糖提取液中含有细胞壁多糖、细胞壁残渣以及大量的盐分和小分子糖，通过离心分离去除细胞壁残渣，然后采用超滤去除盐和小分子糖，从而获得高纯度的细胞壁多糖溶液。处理工艺如下:

此工艺的核心问题是超滤分离，通过透析可去除大部分盐分和小分子糖分，本实验研究了不同透析下的脱盐效果与多糖截留率，考虑到生产的可行性和膜装置的成熟性，并选用双酚A聚砜中空纤维膜进行了脱盐透析试验。

1.3.7 分析检测方法

(1)可溶性固形物含量的测定:采用手持折射仪法。

(2)细胞壁多糖含量的测定:采用酸水解的方法将废弃啤酒酵母细胞壁多糖降解为单体，再利用高效液相色谱仪对相对单体进行定量分析[11］。

(3)提取得率的计算

m1为提取液的可溶性固形物含量，m2为原料的质量。

2 结果与讨论

2.1 温度、时间、pH值、自溶促进剂和料液比等单因素对啤酒废弃酵母自溶的影响

2.1.1 温度、时间、pH值、剪切微化作用等因素对啤酒废弃酵母自溶的影响

在料液比为1∶10，不添加自溶促进剂的条件下，分别考察在pH值为6.0，自溶9 h时温度对啤酒酵母自溶的影响，在pH值6.0，温度为50℃时自溶时间对啤酒酵母自溶的影响，在温度为50℃，自溶9 h时pH对啤酒酵母自溶的影响，以及剪切微化作用对啤酒酵母自溶的影响，结果如图1所示。

图1 温度(a)、pH值(b)、处理时间(c)和剪切时间(d)等单因素对酵母自溶的影响

图1-(a)表示酵母在pH值6.0，自溶9 h的条件下，温度为50～60℃时，啤酒酵母的自溶效果较好，这与张晓鸣等报道的啤酒酵母最佳自溶温度(54℃)相符[12］。从图1-(b)可以看出，随着时间的延长，可溶性固形物的含量越来越高，8 h处理时间下的固形物含量是2 h条件下的2倍多。但9 h后，可溶性固形物的增长变缓，考虑到实际生产效率情况，酵母的自溶时间选为9 h为宜。酵母的自溶也是在其体内酶的作用下进行的，而环境的pH值将直接影响到酵母细胞体内酶的活性。酵母在50℃，不同pH值条件下，自溶9 h后，其可溶性固形物的含量变化如图1-(c)所示，当pH值为5.0～6.0时，酵母自溶效果较好。图1-(d)表明，剪切微化时间越长，可溶性固形物有增高的趋势，说明剪切微化可以提高酵母自溶的效率，但变化不显著，考虑到生产的简便性，只是将料液均质一遍，而不作其他剪切微化处理。

2.1.2 NaCl、VB2等自溶促进剂和料液比对啤酒废弃酵母自溶的影响

在酵母自溶过程中，添加自溶促进剂可加速酵母的自溶，提高酵母提取物的溶出率，缩短自溶时间。从食品安全性考虑，生产中选用食盐和VB2作为酵母自溶促进剂，考虑到产品的口感以及维生素的限量添加，NaCl的添加量定为0.8%，VB2定为200 mg/L，在料液比为1∶10，pH值为6.0，温度为50℃的条件下考察自溶促进剂对酵母自溶的影响，结果如图2所示。

从图2可以看出，添加NaCl和VB2对酵母自溶效率有影响，两者均可缩短自溶时间。如在0.8%的NaCl浓度下，仅需5 h就能使可溶性固形物含量达到5%，而无NaCl的情况下需要10 h才能达到相同的水平[图2-(a)］。同样，添加VB2也可以大大缩短自溶时间，从而达到加速催化自溶的效果[图2-(b)］。

除了自溶促进剂对酵母自溶有一定的作用外，在pH值为6.0，温度为50℃，自溶9 h时，不同料液比对啤酒酵母自溶的影响，实验结果如表1所示。

表1 料液比对啤酒废弃酵母自溶的影响

图2 食盐(a)和VB2(b)对酵母自溶的影响

表1可以看出，料液比越高，提取率越大，但是考虑到实际生产情况以及生产成本，合理的料液比为1∶8～10。因此，啤酒酵母在均质一遍后的适宜自溶条件为:自溶温度是50～60℃，pH值为5.0～6.0，自溶时间为4～5 h，VB2添加量为200 mg/L，NaCl浓度为0.8%，料液比为1∶8～10。在此条件下的最终提取得率可达70%。

2.2 酵母提取物的微胶囊化实验结果

本实验采用离心喷雾进行酵母提取物粉末化(微胶囊化)，根据喷雾塔的特性，选择进风温度160～170℃，排风温度80～90℃，塔温92～100℃，酵母提取物浓度35%～40%。影响酵母提取物粉末化最主要因素是囊壁材料的类型与比例，根据酵母提取物的特性，可选择的微胶囊化囊壁材料包括明胶、阿拉伯胶、改性淀粉、酪蛋白钠、聚乙二醇和甲基纤维素等，在喷雾过程中溶化后的壁材在酵母提取物颗粒表面形成覆膜，可有效阻隔空气中水分的进入，预防产品吸潮。在囊壁材料含量为3%的条件下，各种囊壁材料的微胶囊化效果如表2所示。

表2 各种囊壁材料对微囊化的喷雾效果

从表2可以看出，明胶、阿拉伯胶或者聚乙二醇和甲基纤维素作为囊壁材料时，容易出现喷雾产品凝结且严重粘壁的现象，单独使用改性淀粉或酪蛋白钠作为囊壁材料，喷雾产品容易吸潮成凝结;但是当组合使用酪蛋白钠和改性淀粉时，喷雾时不粘壁，粉末化效果好，产品不吸潮。在此基础上，按照1∶1，1∶2，2∶1不同比例混合酪蛋白钠和改性淀粉，将囊壁材料含量分别定为2%、3%、4%、5%时，考察其喷雾效果。实验表明，酪蛋白钠和改性淀粉的比例为1∶1，囊壁材料含量为3%时，喷雾不粘壁，下粉正常，产品不吸潮，收粉率达到89%。

2.3 酶制剂、温度、时间、pH值、碱浓度对废弃啤酒酵母生物破壁的影响

2.3.1 酶制剂对废弃啤酒酵母生物破壁的影响

各种酶制剂对酵母细胞壁的破壁效果不同。本试验采用蛋白酶，葡萄苷酶和黄藤节杆菌酶3种酶对废弃啤酒酵母进行破壁处理，结果表明葡萄苷酶破壁不完全，得率低;黄藤节杆菌酶和蛋白酶的破壁效果都非常好，但是黄藤节杆菌酶的价格高。综合考虑，使用蛋白酶对废弃啤酒酵母进行破壁处理是较佳选择。因此，设计了不同浓度的蛋白酶并进行了酵母破壁试验，见表3。

表3 蛋白酶的添加量对酵母细胞壁多糖提取率的影响

表3结果显示，添加蛋白酶浓度越高，提取率越大，从产业化和成本方面综合考虑，选择蛋白酶添加量为0.02%～0.03%即可满足实际生产需要。

2.3.2 温度、时间、pH值以及NaOH浓度对生物破壁的影响

在确定了蛋白酶用量0.02%、料液比为1∶10后，分别考察在pH值为12.0，NaOH浓度为3%，反应5h的条件下，反应温度对破壁的影响;在温度为50℃，pH值为12.0，NaOH浓度为3%的条件下，反应时间对破壁的影响;在温度为50℃，NaOH浓度为3%，反应5h的条件下，pH对破壁的影响;以及在温度为50℃，pH值为12.0，反应5h的条件下，NaOH浓度对破壁的影响，结果如图3所示。

图3表示温度、反应时间、pH值和NaOH浓度对生物破壁效率的影响。考虑到酵母细胞本身的结构耐性和蛋白酶的最适作用条件，实验结果表明作用温度在50～60℃为宜[图3-(a)］;在温度为50℃，pH值为12.0，NaOH浓度为3%的条件下，反应时间越长，破壁效果越好，但是考虑到维持作用温度需要的能耗和实际破壁效率，适宜反应时间为5 h[图3-(b)］;图3-c显示pH值对生物破壁有非常显著的影响，碱性条件下(pH 12)的破壁效果是酸性条件下(pH 4)的2倍还多，因此本实验设计了不同质量浓度NaOH，观察碱浓度对生物破壁的影响[图3-(d)］。图3-(d)表明，将 NaOH浓度从3%提高到6%，可溶性固形物的产量增加不明显，碱浓度过高反而会造成产物杂质太多，还可能造成环境污染，故选择3%浓度添加量为宜。此外，本实验还研究了料液比对提取率的影响，发现料液比为1∶10时，生物破壁效率最高。因此，综合以上单因素实验，提取细胞壁多糖的最宜工艺参数是:碱浓度为3%;温度为50℃;时间为5 h;料液比为1∶10。在此工艺条件下，细胞壁多糖提取率为85%。

图3 温度(a)、作用时间(b)、pH值(c)和NaOH浓度(d)对生物破壁效率的影响

2.4 酵母细胞壁多糖提取液的超滤实验结果

根据细胞壁多糖的分子量和溶液特性，文中选用双酚A聚砜中空纤维膜，膜面积为0.25 m2，截留分子质量70 ku，实验最高温度为50℃，流量为20～50 L/h，影响超滤的因素很多，包括pH值、透析比、澄清度等，其中pH值决定于提取液，为9.5，澄清度可由离心决定，因此重点考察透析比对脱盐效率和多糖截留率的影响，实验结果如图4所示。

图4显示，透析比越大，脱盐效率越高，但多糖截留量越少，因此根据两者的综合结果分析，确定适宜的透析比为2.0，此时，脱盐效率达到90%，蛋白含量＜5%，多糖截留量大于85%，其中，甘露寡聚糖 ＞22%，葡聚糖＞35%。

2.5 酵母细胞壁多糖的产品质量标准与检测结果

图4 透析对脱盐率和多糖残留率的影响

因为糖的保留时间随水的比例减小而减少，故可以采用高效液相色谱仪对糖进行分析。结果显示得到的酵母细胞壁多糖产品质量如下:甘露聚糖 ＞22%，葡聚糖＞35%，细胞壁多糖的提取得率＞85%。此外，实验过程中，经测定水回收率＞70%，排出的废水指标(COD＜200 mg/L，BOD＜150 mg/L)达到国家废水排放标准。

3 结论

本实验采用催化自溶与生物破壁技术生产细胞壁多糖，通过一系列实验，最终确定了酵母细胞壁多糖的适宜提取条件。在此条件下，可以显著减少酵母细胞的自溶时间，有效保护甘露糖和葡聚糖的天然结构。同时采用聚砜超滤膜分离技术分离提纯，实现了清洁生产，最终可使甘露糖得率＞22%，使葡聚糖得率＞35%，产物脱盐率＞90%，多糖截留率＞85%。本实验中，除了制备的细胞壁多糖具有免疫调节作用和吸附病原菌及霉菌毒素的功效之外，另外一种产物酵母提取物(酵母精)是兼具营养、调味等功能的优良食品添加剂和调味剂，可广泛应用到调味料、香精、休闲食品和焙烤食品等诸多领域。

利用啤酒酵母生产高品质酵母提取物和细胞壁多糖的项目研究，可降低啤酒企业的环保费用，增加企业的经济效益，替代进口产品，因此，该项目具有显著的经济效益和社会效益。

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ABSTRACTThis paper discussed the use of waste beer yeast to produce cell wall polysaccharides with catalytic autolysis and cell wall deconstruction technology.Through single factor experiments，the best autolysis efficiency of the yeast were as follows:50～60℃，pH 5.0～6.0，0.8%NaCl and 200 mg/L VB2，solid-liquid ratio 1∶(8～10)，shearing treatment at least 9h.Also，the best extraction conditions for extraction polysaccharide were:60℃，solidliquid ratio 1/10，0.02%～0.03%protease and 2%NaOH.In this method，we can get at least 22%poly-mannose and 35%poly-glucan from the cell wall polysaccharides.Sodium casein and modified starch combination was the best microencapsulated material due to its good spray effect and moisture resistance.

Key wordsbeer waste yeast，catalytic autolysis，cell wall polysaccharides，functional foods

Extraction of Polysaccharide from Brewer＇s Yeast Cell Wall Using Catalytic Autolysis and Biological Cell Wall Deconstruction Technology

Duan Sheng-lin，Wang Xue，Yuan Peng，Liu Yan-qiao，Liu Jie，Liu Shi-wei
(China Natiunal Research Institute of Food ＆ Fermentation Industries，Beijing 100027，China)

硕士，高级工程师。

2012-03-01，改回日期:2012-03-23