膜分离纯化罗汉果蛋白酶的研究

苏小建，黄世好，陈广仁，秦少艳，谢丽霞，黄继来

（广西师范大学化学与化工学院，广西桂林541004）

膜分离纯化罗汉果蛋白酶的研究

苏小建，黄世好，陈广仁，秦少艳，谢丽霞，黄继来

（广西师范大学化学与化工学院，广西桂林541004）

应用超滤技术对经硫酸铵法浓缩的罗汉果粗酶进行分离纯化，采用截留分子量为10万、5万和1万的超滤膜对罗汉果粗酶进行分离，用酪蛋白法和考马斯亮蓝染色法分别测定酶活和蛋白质含量。研究发现酶活与蛋白质主要分布在相对分子量为10万以上和5万与1万之间，相对分子量为10万以上酶活占总酶活的28.0%，酶比活提纯了1.88倍，蛋白质量占总蛋白质量的31.7%；相对分子量为5万和1万之间的酶活占总酶活的31.2%，酶比活提纯了2.43倍，蛋白质量占总蛋白质量的33.8%。

罗汉果粗酶；膜分离；酶活；硫酸铵法

Abstract:Siraitia Grosvenorii crude enzyme of ammonium sulfate concentration were isolated and purified by Ultrafiltration technique.Then it was separated by using the ultrafiltration membrane whose molecular weight cut off is 10 million,50000 and 10000 separately.After that,it can use Casein and Coomassie brilliant blue method to measure the enzyme activity and protein content.The research found that the enzyme activity and protein mainly were distributed in molecular weight which was more than 10 million or between 50000-10000.Molecular weight of 10 million or more activity in 28.0%of the total activity of the enzyme specific activity was 1.88 times purification,protein 31.7%of the total protein;relative molecular weight of 50000 and 10000 of the total enzyme activity between 31.2%live,enzyme specific activity was 2.43 times purification,protein 33.8%of the total protein.

Key words：Siraitia grosvenorii crude enzyme;membrane separation;enzyme activity;ammonium sulfate method

罗汉果是我国的特有资源，有关罗汉果产品的开发利用呈急剧上升趋势，但2000年对罗汉果的研究开发与应用主要集中于罗汉果中的甜甙和黄酮[1]，而果实中大量的有效成分如蛋白酶、蛋白质、氨基酸等并没有得到重视和充分利用，相关的文献报道也很少。据研究[2]表明鲜罗汉果中含有对酪蛋白高水解活性的蛋白酶，蛋白酶是目前工业用酶的三大主要酶制剂之一，是工业酶种中用得最多的一种酶，约占酶总量的60%，在相同条件下,罗汉果蛋白酶活性是木瓜蛋白酶活性的10倍以上，具有很高的开发利用价值。本实验提高了罗汉果有效成分的利用率和产品附加值，为充分利用优质罗汉果资源开辟一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

罗汉果蛋白酶[3]：由广西师范大学思特新技术公司提供。

1.2 仪器与设备

SJM-GDM-01型多功能有机膜设备：合肥世杰膜工程有限责任公司；DR2800分光光度计：美国哈希公司；pHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；LXJ-Ⅱ型离心沉淀机：上海医用分析仪器厂；TDL-50B型低速台式大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；电热恒温水浴锅：上海医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 硫酸铵沉淀法[4]

称取50 g粗酶于烧杯中，加蒸馏水摇匀至完全溶解，将烧杯放在另一装有冰水的大烧杯里，并置于磁力搅拌器上搅拌，在5min~10min内边搅拌边徐徐加入硫酸铵至饱和度为50%，继续搅拌20 min；3000 r/min离心30 min；弃去上清液，将沉淀悬浮于2倍沉淀物体积的缓冲液中，离心除去残留的不溶物。得到20 L残留物浓度为1%左右的罗汉果蛋白酶汁。

1.3.2 蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝染色法[5]）

1）标准蛋白质溶液：称取10 μg牛血清白蛋白溶于100 mL蒸馏水中，至标准蛋白质浓度100 μg/mL。

2）样品测定：取蛋白质溶液样品1.0 mL于试管中，加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，静置5 min，在595 nm处测定吸光度，记录A595。根据所测A595，对照牛血清白蛋白标准曲线确定所测蛋白质的浓度。

标准曲线的绘制：取6只试管，按表1加入各试剂。加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后摇匀，静置2 min后在595 nm处测定并记录A595。以不同浓度的牛血清白蛋白（1 μg/mL~10 μg/mL）为横坐标，A595为纵坐标，作标准曲线。

表1 标准曲线溶剂配加表Table 1 Standard curve of solvent with addition of tablemL

1.3.3 罗汉果蛋白酶酶活的测定（酪蛋白法[6]）

准确量取10 mL待测样品于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容（稀释倍数可示样品而定,稀释后固体含量为0.15 mg/mL），摇匀。准确量取1 mL，置具塞试管中于（37±0.2）℃水浴中保温10 min，精密量取在（37±0.2）℃中保温的酪蛋白溶液5 mL，迅速加入混匀，同时启动秒表，准确反应10 min，立即加入三氯醋酸溶液5 mL，摇匀，离心 15 min（4000 r/min），取上清液。另取1 mL样品溶液，按上述方法交换酪蛋白与三氯醋酸溶液的添加次序进行试验，取上清液作空白，在595 nm处测定吸光度A。

准确量取酪氨酸标准品50 mg，置于1000 mL容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸定容摇匀，以蒸馏水作空白，在595 nm处测定吸光度As。

2 结果与讨论

2.1 试验数据及处理结果

2.1.1 标准曲线绘制结果

所得的标准曲线在 2.0 μg/mL~10 μg/mL浓度范围内保持线性关系，结果如图1。

2.1.2 罗汉果蛋白酶酶活的测定结果

在595 nm处测定吸光度As，经测定得As=0.266。

计算每克罗汉果蛋白酶活力单位表述的公式为：

2.1.3 膜分离前后罗汉果蛋白酶成分的分布

在室温（23℃）与操作压力0.05 MPa条件下，把50 g粗酶经硫酸铵法浓缩的罗汉果粗酶溶液依次用切割分子量为10万、5万和1万的滤膜进行渗滤（见图1），罗汉果蛋白酶溶液则被分为3份（切割分子量为1万的膜作用是把1万～5万滤液浓缩），得到膜分离前后相关数据如表2。

2.2 罗汉果粗酶酶活的分布

酪蛋白法测过膜前及过膜后每段溶液中总酶活的含量，得总酶与酶比活比较与分布见图2和图3。

表2 多功能有机膜分离前后的有关数据Table 2 Multifunctional organic membrane separation before and after the relevant data

注：附表中相关数据计算过程为总酶活力（kat）=酶活（kat/mL）×体积（L）× 1000；酶比活（kat/g）= 总酶活力（kat）/总蛋白质含量（g）；酶活提纯倍数=每一步的酶比活（kat/g）/粗酶比活（kat/g）；蛋白质量=蛋白质百分数（%）×总固重。

从图2和图3可以看出：粗酶用硫酸铵法浓缩处理后总酶活4412.77 kat，比处理前粗酶的6464.17 kat少了2051.4 kat，损失了31.7%，酶比活168.54 kat/g，提纯了1.30倍；再经不同孔径的超滤膜分离后，相对分子量为10万以上的总酶为1820.87 kat，占总酶活的28.0%，酶比活为243.46 kat/g，提纯了1.88倍；相对分子量为5万～10万的总酶为107.48 kat，占总酶活的0.2%，酶比活为15.26 kat/g；相对分子量为1万～5万的总酶为2017.13 kat，占总酶活的31.2%，酶比活为297.20 kat/g，提纯了2.29倍；可见粗酶经硫酸铵法浓缩再经不同孔径的超滤膜分离后，酶活主要分布在相对分子量为10万以上和1万～5万之间，而5万～10万之间仅有极少量的酶活。超滤分级纯化可以很方便的得到罗汉果蛋白酶酶活的相对分子量分布，对罗汉果蛋白酶纯化及药理作用都有指导意义。

3 结论

罗汉果粗酶经硫酸铵法浓缩再经不同孔径的超滤膜分离后，酶活与蛋白质主要分布在相对分子量为10万以上和1万～5万之间。相对分子量为10万以上的酶活占总酶活的28.0%，酶比活提纯了1.88倍，蛋白质量占总蛋白质量的31.7%；相对分子量为1万～5万之间的酶活占总酶活的31.2%，酶比活提纯了2.43倍，蛋白质量占总蛋白质量的33.8%；两者之和占了总酶活的59.2%，占总蛋白质的65.5%，具有很高的开发利用价值。

[1]陈全斌,阮谊波,李晓英,等.广西科研工作者对罗汉果研究现状分析[J].广西轻工业,2007,103(6)：14-15

[2]苏小建,梁成钦,何星存,等.罗汉果蛋白酶的提取方法比较[J].食品工业科技,2007,28(2)：157-162

[3]刘国雄.罗汉果蛋白酶的分离纯化及性质研究[D].广西师范大学,2007：27,39-40

[4]汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社,2000：65-67

[5]俞建瑛,蒋宇,王善利.生物化学实验技术[M].北京：化学工业出版社 2005：177-178

[6]施特尔马赫.酶的测定方法[M].钱嘉渊,译.北京：中国轻工业出版社,1992：47-48

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[9]王学松.现代膜技术及其应用指南[M].北京：化学工业出版社,2005：14-15

Studies on Membrane Separation and Purification of Siraitia Grosvenorii Protease

SU Xiao-jian,HUANG Shi-hao,CHEN Guang-ren,QIN Shao-yan,XIE Li-xia,HUANG Ji-lai
（Guangxi Normal University，Guilin 541004，Guangxi，China）

2012-01-11

广西环境工程与保护评价重点实验室项目（200912）

苏小建(1957—），男（汉），教授级高级工程师，硕士，主要从事天然产物的研究与开发。