HPLC-梯度洗脱测定保健食品中吡啶甲酸铬

那海秋，马殿君，赵飞

（辽宁省食品药品检验所，辽宁沈阳110023）

HPLC-梯度洗脱测定保健食品中吡啶甲酸铬

那海秋，马殿君，赵飞

（辽宁省食品药品检验所，辽宁沈阳110023）

建立保健食品中吡啶甲酸铬成分的检测方法。高效液相色谱法，三元流动相体系-梯度洗脱，C18反向色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温 25 ℃，检测波长为 254 nm，流速为 0.5 mL/min，进样量为 10 μL。吡啶甲酸铬在 0～92.88 μg/mL之间具有良好的线性关系，相关系数R=0.9997，2个浓度平均加标回收率分别为92.90%、96.19%。本方法对保健食品中吡啶甲酸铬具有较好的分离效果和精密度，梯度洗脱缩短了样品检验时间，适用于保健食品中吡啶甲酸铬的定量检测。

吡啶甲酸铬；高效液相色谱；梯度洗脱；保健食品

Abstract:To develop a method for determining the content of chromium picolinate in sanitarian food.The HPLC was carried out with C18-BP(5 μm,4.6 mm×250 mm)column set at 25 ℃.The mobile phase was phosphoric acid,methanol and acetonitrile with flow rate of 0.5 mL/min.The detection wavelength was set at 254 nm,and the sample size was 10 μL.The linearity of the method ranged from 0 to 92.88 μg/mL and R=0.9997.The average recovery rate was 92.90%and 96.19%for 2 kinds of concentration.High-performance chromatogrphic method is steady and reliable for detecting the concentration of chromium picolinate and it is applicable for analyzing chromium picolinate in sanitarian food.

Key words：chromium picolinate;HPLC;gradient elution;sanitarian food

过去铬和其他一些元素如镍、铅、镉等一样，一直被认为是对人畜有毒有害的元素之一[1]。随着现代科学研究的不断发展，到20世纪70年代，人类才逐渐认识到铬是人和动物必需的微量元素[2]。铬有3种价态，有二价铬、三价铬及六价铬，其中六价铬毒性最大。而三价铬是铬在人畜体内存在的稳定形式，其化合物参与骨骼的形成和蛋白质、脂肪、糖代谢及胰岛素的生化过程，并对血红蛋白合成及造血过程具有促进作用[2]。吡啶甲酸铬就是三价铬化合物，可以被人体很好的吸收，因此吡啶甲酸铬是一种被食品药品监督管理局允许能够添加到保健食品中的功效成分之一。根据《营养素补充剂申报与评审规定》中规定三价铬日摄入量范围可知，吡啶甲酸铬作为保健食品中的功效成分其含量控制非常重要[3]。

1 材料和方法

1.1 试剂

甲醇、乙睛色谱纯；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾分析纯；吡啶甲酸铬对照品进口，批号：13363，干燥条件：105℃干燥4 h。

1.2 仪器

高效液相色谱仪（型号LC2010）：日本岛津公司，带紫外检测器，色谱工作站；DT5-2离心机：北京时代北利离心机有限公司；AS10000377超声波清洗仪：天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.3 色谱条件

C18反向色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；流动相：磷酸盐缓冲溶液∶甲醇∶乙腈梯度洗脱，见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Conditions of gradient elution

1.4 测定方法

1.4.1 标准品溶液制备

称取105℃干燥4 h的吡啶甲酸铬对照品0.01161 g于25 mL容量瓶中，加甲醇∶水=1∶1完全溶解并定容至刻度，即为0.4644 mg/mL吡啶甲酸铬标准溶液。

1.4.2 标准系列

取上述吡啶甲酸铬标准溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 分别置于 10 mL 容量瓶中，以甲醇∶水=1∶1水溶液定容至刻度（相当于每毫升含吡啶甲酸铬分别为 0、4.644、9.288、18.576、37.152、55.728、74.304、92.88 μg），摇匀，经 0.45 μm 滤膜过滤后备用。

1.4.3 样品处理

准确称取混匀的样品约2 g左右（精确至0.1 mg），于25 mL容量瓶中，加甲醇∶水=1∶1水溶液约20 mL，超声提取10 min，并用甲醇∶水=1∶1水溶液定容至刻度，摇匀后转移至离心管中，以3000 r/min离心10 min，经0.45 μm滤膜过滤后备用。

1.4.4 测定

按照上述仪器条件，将标准系列溶液从低到高依次进样上机测定，以保留时间定性，以峰面积为纵坐标，标准系列浓度为横坐标绘制标准工作曲线，并求出回归方程。样品溶液依次进样，同样以保留时间定性，以峰面积从标准工作曲线或回归方程计算吡啶甲酸铬浓度。图1为标准系列中9.288 μg/mL谱图，图2为某样品谱图。A为吡啶甲酸铬峰。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

2.1.1 磷酸盐缓冲溶液-乙腈体系

首先选择了磷酸盐缓冲溶液-乙腈作为流动相体系，磷酸盐缓冲溶液∶乙腈=85∶15，分离效果不好；在此基础上调整了流动相的比例，磷酸盐缓冲溶液：乙腈从70∶30到92∶8，其分离效果都不是很好，故对其它流动相体系进行了试验。

2.1.2 磷酸盐缓冲溶液-甲醇-乙腈体系

根据有关资料报道对磷酸盐缓冲溶液-甲醇-乙腈流动相体系进行了试验，当磷酸盐缓冲溶液∶甲醇∶乙腈=85∶10∶5时样品中吡啶甲酸铬与其它组分分离的较好，因此选择了磷酸盐缓冲溶液∶甲醇∶乙腈=85∶10∶5 作为流动相。

2.1.3 流动相中磷酸盐缓冲溶液pH

试验中对流动相中磷酸盐缓冲溶液pH进行了考察，分别对 pH=3、pH=4、pH=5.8、pH=7.8 进行了比对试验，结果发现pH不仅对保留时间产生影响，而且对分离效果影响很大。pH=3时吡啶甲酸铬保留时间在19 min~20 min之间，分离效果不理想。pH=4、pH=7.8时吡啶甲酸铬保留时间均在15 min~16 min左右，但两者分离效果差异很大，pH=7.8时样品分离效果不好，且保留时间漂移较大。pH=4时分离效果尚可，保留时间稳定，但灵敏度稍差，标准系列中4.644 μg/mL的响应值为127088。pH=5.8时吡啶甲酸铬保留时间在14 min左右，保留时间稳定，且相对其它pH磷酸盐缓冲溶液分离效果较好，灵敏度较高，标准系列中4.644 μg/mL的响应值为184155。综合考虑分离效果、保留时间、灵敏度等因素确定流动相中磷酸盐缓冲溶液pH=5.8为最佳。

2.2 梯度洗脱

众所周知保健食品成分较复杂，若按上述条件等度洗脱每个样品大约需要80 min左右才能完成所有组分的洗脱，造成样品分析时间过长，既影响工作效率又浪费试剂试药，因此试验中采用了梯度洗脱法，并对梯度洗脱时间进行了摸索试验，通过比较认为1.3色谱条件表中洗脱时间较为合适，45 min既能完成样品所有组分的洗脱，节省了近一半的分析时间，且不影响样品分析结果。

2.3 线性关系

取1.4.2标准系列按上述条件上机测定，其结果见表2。

表2 吡啶甲酸铬标准系列检测结果Table 2 Test results of standard series for chromium picolinate

以峰面积为纵坐标，标准系列浓度为横坐标绘制标准工作曲线，线性回归方程为：

Y=39994X-4001.5相关系数R=0.9997从表2及相关系数R可以看出吡啶甲酸铬浓度在0～92.88 μg/mL之间具有良好的线性关系。

2.4 吡啶甲酸铬加标回收率、精密度、稳定性试验

2.4.1 加标回收率

取已知吡啶甲酸铬含量为20 mg/100 g的样品做2个浓度加标回收实验，每个浓度作6份平行样品，每份约2 g，浓度一各加0.4644 mg/mL吡啶甲酸铬标准溶液1 mL，浓度二各加0.4644 mg/mL吡啶甲酸铬标准溶液2 mL，按上述样品处理方法定容25 mL制备样品溶液，按上述仪器条件上机测定，结果见表3。

表3 吡啶甲酸铬加标回收实验Table 3 Standard addition recovery experiments of chromium picolinate

2.4.2 方法精密度试验

取混合均匀相同样品6份按上述相同方法处理样品上机测定，结果见表4。

表4 吡啶甲酸铬方法精密度实验结果Table 4 The results of method precision for chromium picolinate

2.4.3 稳定性试验

将处理好的某样品及标准系列中18.576 μg/mL标准溶液分别放置 1、8、16、24、48 h 在相同条件下测定，其保留时间、峰面积均无明显变化，结果表明处理后的样品溶液及标准溶液在48 h内稳定。

3 结论

一般来说保健食品成分都很复杂，检测过程中影响及干扰因素较多，因此能够取得好的分离效果非常重要。相对于GB/T 5009.195-2003保健食品中的吡啶甲酸铬含量的测定[4]及参考文献保健食品中吡啶甲酸铬的高效液相色谱测定法[5]，本研究建立的高效液相色谱法—三元流动体系梯度洗脱测定保健食品中吡啶甲酸铬，具有快速、准确、稳定、分离效果好，出峰时间适中等优点，通过梯度洗脱大大缩短了检验时间。在本实验研究范围内吡啶甲酸铬具有良好的线性关系、回收率及精密度，已运用于某些胶囊、片剂保健食品中功效成分—吡啶甲酸铬的检测。

[1]李敏,郭书明,袁宝清,等.吡啶甲酸铬的生物学作用及其应用[J].河南畜牧兽医,1999,20(9)：20-21

[2]李致宝,韦少平,夏中生,等.吡啶甲酸铬的研究概述及其应用进展[J].化工技术与开发,2011,40(7)：11-14

[3]国家食品药品监督管理局.国食药监注[2005]202号《营养素补充剂申报与评审规定(试行)》[S].北京：国家食品药品监督管理局,2005：2

[4]中华人民共和国卫生部,中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.195-2003食品卫生检验方法理化部分(二)：保健食品中的吡啶甲酸铬含量的测定 [S].北京：中国标准出版社出版,2003：543-547

[5]廖一民.保健食品中吡啶甲酸铬的高效液相色谱测定法[J].预防医学情报杂志,2005,21(6)：751-753

Determination of Chromium Picolinate in Sanitarian Food with Gradient Elution-HPLC

NA Hai-qiu,MA Dian-jun,ZHAO Fei
（Liaoning Institute for Food and Drug Control,Shenyang 110023,Liaoning,China）

2012-01-12

那海秋（1960—），女（满），高级工程师，本科，主要从事食品保健品检测及方法研究。