磷脂酶A1(Lecitase Ultra)大孔树脂固定化研究

曹茜，汪勇，唐书泽

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

磷脂酶A1(Lecitase Ultra)大孔树脂固定化研究

曹茜，汪勇*，唐书泽

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

选用9种树脂对磷脂酶A1（Lecitase Ultra）进行固定化，比较得出最适合的固定化载体为D101型号的大孔树脂。对其固定化条件进行优化，得到了固定化最优的条件为：酶液和树脂液料比1∶1（mL/g），磷酸盐缓冲液pH为6.5，室温下固定化时间60 min。在此条件下的得到的固定化酶的酶活力为750.0 U/g。通过扫描电子显微镜观测了固定化前后，树脂表面特征的变化。

磷脂酶A1；固定化；大孔树脂；水解

Abstract:Nine types of macroporous resins were tested for immobilization of phospholipase A1(Lecitase Ultra),and D101 resin was selected as the carrier for this immobilization.The optimal conditions for immobilization of Lecitase Ultra by D101 resin were obtained as follows：ratio of enzyme solution to carrier 1∶1(mL/g)，adsorption time 60 min at ambient temperature,and phosphate buffer pH 6.5.The activity of immobilized Lecitase Ultra under the optimal conditions was 750.0 U/g.scanning electron microscope was introduced to investigate the changes of resin surface before and after the immobilization.

Key words：Phospholipase A1;immbolization;macroporous resin;hydrolysis

磷脂酶A1是一类可以催化水解磷脂Sn-1位酯键获得2-酰基-溶血磷脂和脂肪酸的酶，它广泛存在于动植物和微生物组织中[1]。水解得到的溶血磷脂产品在食品、化妆品和药品行业有着广泛的应用[2]。价格低廉的磷脂酶A1在工业上具有巨大的应用价值，但是目前国内外对前磷脂酶A1的相关研究主要集中在酶法脱胶技术方面[3-5]。

酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,使之仍具有特有的催化反应功能且能回收重复使用的一类技术[6]。和所有游离酶一样，液体的磷脂酶A1在使用上存在不易回收利用,使用式一次成本相对较高等问题[7]。固定化就可以较好地解决这个问题，将酶固定在高比表面积的载体上,可扩大其与底物的接触面积,有利于底物分子的扩散,同时提高酶的热力学稳定性。同时固定化可以调节和控制酶的活性和选择性,有利于酶在有机溶剂中的反应,并可以很方便地从反应体系中分离和重复使用[8]。酶的固定化方法很多，常用的有物理吸附法、共价偶连法、包埋法和交联法[9-14]。相比而言，物理吸附固定化操作简单，对酶的结构影响较小，固定化后酶活力较高。

采用9种大孔树脂为载体对磷脂酶A1进行固定化，通过比较固定化酶水解油脂的效率来判断固定化活性，筛选较好的固定化酶的树脂，并对该种树脂的固定化条件进行优化。采用扫描电镜对固定化酶进行了结构表征。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

磷脂酶A1（Lecitase Ultra）：丹麦诺维信公司；大豆油：东海粮油工业有限公司；考马斯亮蓝G-250：阿拉丁试剂公司；牛血清蛋白：广州市齐云生物科技公司；大孔树脂，型号：D113 、D151、D152、D101、Ab-8 、110、CD-180和Dk110：安徽三星树脂科技有限公司；Amberlite XAD-2大孔树脂：美国罗门哈斯公司。其它试剂为AR级，购于广州市东巨化学试剂有限公司。

W5180P型恒温浴锅和搅拌器：广州华兴科仪公司；DT5-4型离心机：北京时代北利离心有限公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱：上海恒一科技有限公司；S-3700N型电子扫描显微镜：德国布鲁克仪器公司；PHS-3E型pH计：广州华兴科仪公司；DZF6050真空干燥箱：上海恒一科技有限公司；UV9600紫外可见分光光度器：北京瑞利分析仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 载体大孔树脂的预处理

吸附用大孔树脂采用无水乙醇浸泡24h，再依次用5%的HCl和5%的NaOH溶液浸洗树脂并滤干5次~6次，用去离子水洗至中性后最后用pH 6.8磷酸缓冲液（0.02 mol/L）浸泡待用[15-17]。

1.2.2 吸附用大孔树脂的选择

在小烧杯中放入2 g大孔树脂吸取2 mL酶液加入10 mL 0.1%的CaCl2溶液，室温振荡吸附4 h，上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白，计算树脂对酶蛋白的吸附率，方法详见1.2.4。参照磷脂酶A1催化水解大豆油的方法[18]，测定固定化酶的酶活性，从中选取合适型号的树脂作为固定化酶载体。催化水解大豆油的具体条件为：大豆油20.0 g、8.0 g 0.1%的氯化钙溶液、反应温度35℃、反应时间1 h、摇床转速180 r/min。定义单位时间（min）水解大豆油，释放出产物脂肪酸的微摩尔量为一个酶活力单位，比较各种树脂的固定化效果，从中选取较好的固定化载体。

1.2.3 磷脂酶A1（Lecitase Ultra）的固定化优化

将磷脂酶A1酶液、pH 6.8磷酸缓冲液（0.02 mol/L）和处理后的大孔树脂（抽滤干）按照一定的比例混合，在一定的温度下回旋振荡吸附。真空抽滤分离树脂和残留酶液，并用磷酸缓冲液清洗固定化酶多次，将洗净后的固定化酶于25℃下放在培养皿中真空干燥3 h~4 h，4℃冰箱保存待用。

1.2.4 树脂吸附率的计算

载体树脂的蛋白质（酶液）吸附量测定，蛋白质含量测定采用Bradford法（考马斯亮兰染色法）[19]。树脂的蛋白质吸附量的公式如下：

树脂的蛋白质吸附量=（X1·V1-X2·V2）/W1

式中：X1为吸附前每毫升酶液的蛋白质含量，mg；X2为吸附后每毫升酶液的蛋白质含量，mg；V1为吸附前液体的体积，mL；V2为吸附后液体的体积，mL；W1为加入树脂的质量，g。

1.2.5 扫描电镜观测表面结构

采用扫描电镜对固定化酶和树脂表面进行观测，制备电镜样品经过脱水，固定，喷金处理（一般物质的二次成像模糊，在表面采用离子溅射镀膜法可以将样品表面镀上金属离子膜便于观测样品表面形态）后，再观测成像。

2 结果与讨论

2.1 磷脂酶蛋白质标准曲线

以9种大孔树脂为载体，采用物理吸附法对磷脂酶A1进行固定化，2.0 g树脂、2.0 mL酶液（酶蛋白质量为12.40 mg/mL），加入10.0 mL的0.1%的CaCl2溶液，室温振荡吸附4.0 h，所得结果如表1所示。

表1 不同树脂的物化性质以及固定化磷脂酶A1的酶活力和蛋白吸附率Table 1 The physical properties of different resin and phospholipase A1(Lecitase Ultra)enzyme activity of phospholipids and protein adsorption rate

从表1可以看出，大孔树脂对蛋白质吸附率并不与固定化酶的活力成正比，AB-8型树脂对酶蛋白的吸附率最高，为75.75%，但是其固定化酶的活力为331.3 U/g。D101型和Amberlizte XAD-2型这2种树脂对酶蛋白的吸附率非常接近，且固定化酶的酶活力也接近，达到409.2 U/g和409.5 U/g。固定化酶的酶活力一方面由固定化载体吸附的酶蛋白的量决定，更重要是固定化载体（树脂）吸附的酶的空间构型以及载体的孔径以及微环境对酶的活力有着更大的影响。D101型和Amberlizte XAD-2在本研究中都可以成功吸附酶，并保持较高的活力。考虑到国产的D101型树脂在成本上有明显优势，所以本研究选用D101型树脂作为固定化酶的载体。

2.2 树脂D101固定磷脂酶A1(Lecitase Ultra)条件优化

2.2.1 酶添加量（液料比）对固定化效果的影响

D101 型树脂（2.0g）分别添加 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL磷脂酶A（1Lecitase Ultra）酶液，加入10.0 mL的0.1%CaCl2溶液，在温度35℃摇床180 r/min固定3.0 h后抽滤。放入培养皿室温真空干燥4.0 h，然后用于催化水解大豆油，计算其酶活力，结果如图1所示。

图1 酶液添加量对固定化的影响Fig.1 Effect of differernt adding amount of liquid phospholipase A1(Lecitase Ultra)on the activity of phospholipids

从图1可以看出，在固定化阶段随着液料比的增加，固定化酶的活力也随之增加。但是当液料比超过1.0 mL/g时，酶活力增加的趋势变缓。在液料比低时，由于酶蛋白浓度较低，树脂没有饱和吸附，相应的酶活力较低。随着液料比的提高，树脂吸附酶的量逐渐饱和，即使继续增加液体酶，树脂也无法吸附更多的有效蛋白，所以出现了再液料比大于1.0 mL/g时，酶活力增加缓慢的情况。综合是因为树脂吸附酶液的量达到了饱和，随着外界浓度增加会有稍稍的增大，但是不是效果不是很明显。

2.2.2 吸附时间对固定化效果的影响

分别在小烧杯中加入2.0 g D101树脂和2.0 mL酶液和10.0 mL 0.1%CaCl2溶液，在温度35℃摇床180 r/min 固定 20、40、60、80、100 min 后抽滤。放入培养皿室温真空干燥4.0 h，进行水解大豆油实验，结果如图2所示。可以看出，随着固定化时间的增加是先增加再保持基本不变，在60 min到达最佳值，由于大孔树脂的吸附量是一定的，随着时间的增加酶的吸附量增大，在60.0 min时大孔树脂吸附量达到饱和，时间再增加水解效果也不会明显变化，因此过过长的吸附时间不会增加水解效果。

2.2.3 pH对固定化效果的影响

在小烧杯中加入2.0 g D101树脂和2.0 mL酶液,分别加入 10 mL pH 分别为 5.0、6.5、6.8、7.0、7.3 的磷酸缓冲溶液，在温度35℃摇床180 r/min，固定60 min后抽滤。放入培养皿室温真空干燥4.0 h，进行水解大豆油实验，结果如图3所示。

从图3可以看出固定化酶在pH 5~7.5之间时，酶活力随着pH的上升先上升后下降，在pH为6.5时表现为最大酶活力。缓冲液的pH，对维持酶的空间构象以及保持较高酶活力至关重要。D101树脂固定磷脂酶A1最适pH在中性略偏酸性，在工业化应用时，可以简化为不添加缓冲液，直接催化酯化或者水解反应，为该酶的应用带来便利。磷脂酶A1（Lecitase Ultra）在游离状态下最适pH为5.0，而固定化酶最适pH为6.5，证明固定化影响了微环境，导致最适pH发生变化[20]。

2.2.4 最佳固定化磷条件下脂酶酶活的测定及固定化酶的表面

D101 树脂（2.0 g）添加酶液 2.0 mL，在 pH 为 6.5的条件固定化60 min。真空抽滤，放入培养皿室温真空干燥4.0 h。干燥后测得的固定化酶活为750.0 U/g。

用扫描电子显微镜（SEM）对大孔树脂（D101）固定化前和固定化后的表面形态结构的扫描，样品在扫描前先进行喷金处理，用S-3700N型号的扫描电子显微镜获得扫描图片（见图 4），从图 4（a）和（b）可以清晰的观测到，固定化前，树脂表面较光滑，放大1000倍时，可以观测到正常的树脂纹理。从图4（c）和（d）中可以观测到树脂表面吸附了酶蛋白，表面出现了皱折。

图4 a、b为固定化前，c、d为固定化后分别放大倍数为120倍和1000倍Fig.4 a,b before immobilized respectively amplification times for 120 times and 1000 times and c,d respectively amplification times for 120 times and 1000 times

3 结论

比较了9种大孔树脂吸附法固定磷脂酶A1（Lecitase Ultra），通过酶活力和蛋白吸附量选择D101树脂为磷脂酶A1最适合固定化载体。对固定化条件进行了优化，优化条件为：酶液和载体液料比为1∶1（mL/g）、固定化时间60 min、磷酸盐缓冲液pH 6.5。在此条件下得到的酶活为750.0 U/g。通过扫描电镜可以观测到D101树脂在吸附后表面的变化。

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Immobilization and Application of Phospholipase A1

CAO Qian,WANG Yong*,TANG Shu-ze
（College of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China）

2011-12-13

国家自然科学基金项目（31000793）；国家“863”计划项目（2010AA101505）；粤港关键领域重点突破项目（2009A020700003）；广东省科技计划项目（2009B080701063）

曹茜（1987—）,女（汉），在读硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。

*通信作者：汪勇（1977—），男（汉），副研究员，博士，从事功能性油脂的教学与科研。