响应面分析法优化超高压提取柿叶单宁的研究

李 亮，顾熟琴，卢大新，杨 冬

（1.北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206；2.农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京102206）

响应面分析法优化超高压提取柿叶单宁的研究

李 亮1，2，顾熟琴1，2，卢大新1，*，杨 冬1，2

（1.北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206；2.农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京102206）

在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对柿叶单宁超高压提取工艺进行优化。以总单宁得率为指标，考察固液比、提取溶剂浓度、压力值、保压时间对得率的影响。获得最佳提取理论条件为：固液比为1∶25（g∶mL），溶液浓度为56.31%，压力值为222.33MPa，保压时间为3min，总单宁得率为96.19%。与溶剂提取法相比，本方法耗时短，效率高。

超高压，柿叶单宁，溶液提取，响应面分析

Abstract：Based on single factor experiment，the optimal extraction conditions by ultra high pressure extraction process of persimmon tannin were described by response surface method，while the yield of tannins were adopted as indexes.Factors of solid-to-solution ratio，solution concentration，pressure value，and holding pressure time were evaluated for their effects on extraction process.The optimum conditions were as follows：solid-to-solution ratio of 1∶25，solution concentration of 56.31%，pressure value of 222.33MPa，holding pressure time of 3min.The proportion of total persimmon tannin was 96.19%under this conditions.It had time saving and high advantage compared with solvent extraction.

Key words：ultra high pressure；persimmon leaf tannin（PLT）；solvent extraction；response surface method

磨盘柿（Diospyros kakiL.f.cv.Mopan）是北京主栽优良柿品种，为涩柿品种，柿果形如磨盘，采收期在10月中旬，品质优良，在国内外均享有盛名。房山区栽培柿树历史悠久，全区现有磨盘柿8067hm2，占北京市柿树总面积的70%。柿子叶中所含物质原料丰富，其中包含维生素C、单宁、芦丁、胆碱、黄酮甙、类胡萝卜素、多种氨基酸及铁、锌、钙等多种对人体健康有益的营养成分[1]。虽然国内外对其他来源的单宁提取及应用有很多研究报道，但柿子叶中单宁的提取及应用却鲜见文献报道[2]。为充分利用现有的柿树资源，开发高附加值的柿叶单宁产品，研究如何高效的提取柿叶单宁意义重大。目前，单宁提取较为常见的方法有两种：一种是超声波辅助提取法，另一种是盐酸与乙醇的混合溶剂提取法[3-5]。超高压技术作为食品行业非热加工技术一直很受重视，也是一种提取植物原料中有效成分的高新技术。与传统提取技术相比，超高压具有提取时间短、能耗低、杂质少、“绿色”环保，且可避免因热效应引起的有效成分结构变化、损失以及生理活性的降低[6-8]。因此，本文采用超高压技术提取柿叶单宁，并应用响应面分析方法研究其提取工艺，分析不同溶液体积分数、超高压压力、加压时间和固液比对总单宁得率的影响，并且同溶剂提取进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柿叶 2010年10月采于北京房山区磨盘柿柿树黄叶，室温通风干燥后粉碎至60目、双层密封袋置于恒温恒湿箱中保存，在实验前测定柿叶粉的含水量；单宁标准品 北京伟业科创科技有限公司单宁标准品（3G）；配制8g/L氨溶液，其他试剂均为分析纯。

UHPF/3L/600MPa超高压设备 包头科发公司；UV9100D紫外可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司；VORTEX-5漩涡振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TD5A—WS台式低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超高压提取柿叶单宁方法 借鉴本超高压实验室超高压处理通用方法，称取一定量柿叶粉末装入聚乙烯塑料瓶中（75mL），加入一定浓度的乙醇溶液，尽量排除瓶内空气。用手握住塑料瓶振荡5次，使其混合均匀。然后放入超高压萃取釜内，设定条件。塑料瓶中的试样在超高压介质作用下，单宁渗出到乙醇溶液中。将超高压处理后的悬浊液转入离心管中，在3000r/min下离心10min，得到上清液。每个条件做三个平行，测定所得溶液中单宁含量，并计算其得率η。

式中：C1-提取液中的单宁浓度，mg/mL；V1-提取液的体积，mL；M-柿叶粉试样的质量，g；ω-柿叶粉试样中单宁的质量百分比。

根据所测提取液吸光度值，从测定的单宁标准曲线中读取相应的浓度C1。

1.2.2 溶液提取柿叶单宁 根据溶剂提取单宁预实验的正交分析结果，按固液比1∶25称取一定量柿叶粉，加入100mL体积分数50%的乙醇溶液，在60℃恒温下提取2.5h，将所得悬浊液倒入离心管，在3000r/min下离心10min，得上清液，并测定所得液中单宁含量[9-10]。做三次平行样，计算其得率。

1.2.3 单宁标准曲线制定[11]用单宁标准品配标准溶液（2g/L）。用刻度移液管分别加0、1、2、3、4、5mL单宁酸溶液至20mL容量瓶中，用二甲基甲酚胺补充定容到刻度。得到单宁酸含量为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的标准溶液。

用移液管将上述溶液各取1mL移入试管，再加入5mL水及1mL柠檬酸铁铵溶液，再用振荡器振荡5s，然后加1mL氨溶液再用振荡器振荡5s。将上述溶液移到测量杯中，静置（10±1）min后，用分光光度计于525nm处测定吸光度。以水为空白对照。

用吸光度作纵坐标，用标准刻度上相对应的单宁酸浓度（mg/mL）作横坐标，绘制标准曲线。所得标准曲线如图1。

图1 单宁标准曲线Fig.1 Standard curve of tannin

1.2.4 单宁含量的测量方法[11]采用分光光度计测定。用移液管取1mL被测溶液放入试管A中，接着用移液管加6mL水与1mL氨溶液，然后用振荡器振荡5s。用移液管取1mL被测溶液放入试管B中，接着用移液管加5mL水和1mL柠檬酸铁铵溶液，用振荡器振荡5s，然后用移液管加1mL氨溶液，再用振荡器振荡5s。将A、B两管静置10min后，用分光光度计于525nm处测定各自的吸光度，用水做空白对照。A、B两管吸光度之差即为所测溶液的吸光度，代入到标准曲线中计算出对应的浓度值。

1.2.5 单因素实验 以固液比、溶液浓度、压力值、保压时间四因素为自变量，单宁得率为考量值，通过固定其他三个因素，改变某一因素的取值，确定相关因素的影响并为后续响应面实验设计提供各个因素的取值范围[12]。

1.2.6 响应面实验 根据单因素实验结果选定各个因素的零水平和波动区。以单宁得率为响应值，考虑超高压压力值、保压时间、固液比、溶液浓度四因素，设计响应面实验方案。通过Design-Expert软件设计Box-Behnken Design（BBD）实验[13]。实验因素与水平的取值见表1。

表1 响应面实验因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 溶液浓度对单宁得率的影响 在固液比1∶25，压力值300MPa，保压时间3min的条件下，乙醇溶液浓度对单宁得率的影响如图2。

图2 溶液浓度对单宁得率的影响Fig.2 Effects of solution concentrations on extraction rate

从图2可以看出，随溶液浓度的增大，单宁得率先增加后减小。当乙醇浓度达到60%时，单宁得率最高；当乙醇浓度再增加时，单宁得率反而下降。因此乙醇浓度控制在60%左右比较适宜。

2.1.2 压力对单宁得率的影响 在固液比1∶25，保压时间3min，乙醇浓度60%的条件下，分别以100、200、300、400、500MPa提取单宁，测得不同条件下所得单宁得率变化如图3。

如图3所示，当压力低于200MPa时，单宁得率随着压力值增高有所上升。当压力值到达200MPa后，单宁得率随着压力值的升高呈下降趋势。原因是在200MPa以下超高压处理时，3min内柿叶细胞的结构还没有被破坏，乙醇溶液借助高压渗透进入细胞内萃取出单宁分子，当处理的压力值超过200MPa后，细胞壁及细胞膜无法承受3min的超高压力而被破坏，许多杂质渗出影响了单宁分子的提取[14]。

图3 压力值对单宁得率的影响Fig.3 Effect of pressure value on extraction rate

2.1.3 保压时间对单宁得率的影响 在固液比1∶25，压力值300MPa，溶液浓度60%的条件下，保压时间分为1、2、3、4、5min下的单宁提取，结果如图4。

图4 保压时间对单宁得率的影响Fig.4 Effect of holding pressure time on extraction rate

从图4可以看出，0～2min单宁得率随保压时间上升而增高，保压时间2min之后单宁得率开始下降，在3min之后，得率基本没有变化。可能是保压时间达到3min时，细胞组织已经无法承受超高压的作用而被破坏。

2.1.4 固液比对单宁得率影响 在提取压力300MPa，保压时间3min，溶液浓度60%的条件下，以不同的固液比装入塑料瓶，固液比依次1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，测得不同条件下的单宁得率如图5所示。

图5 固液比对单宁得率的影响Fig.5 Effect of the solid-to-solution ratio on extraction rate

可以看出，单宁得率是随固液比的变化而变化，当用更多的溶剂去混合物料时，得率逐渐上升。当固液比达到1∶25之后，单宁得率基本无变化。所以从经济角度考虑，选择1∶25的固液比足以满足提取条件。

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面实验设计 设计结果见表2。

表2 响应面实验设计方案Table 2 Design of response surface method

2.2.2 响应面实验结果分析 响应面分析结果显示如表3。

表3 响应面分析实验结果Table 3 Test results of response surface analysis

表3分析结果中，该模型的F值是49.90，表明模型具有显著性。p值小于0.05表明该因素为显著因素，小于0.001表明该因素极其显著。所以因素溶液浓度极其显著，保压时间及B2具有显著性，但是四个因素之间的交互作用不显著。分析可得二次方程为：

单宁得率=90.97-2.27A-4.75B+1.69C+3.05D+2.65AB+1.44AC+1.71AD+1.03B C+1.77BD-0.44CD-2.08A2-3.72B2-1.92C2+1.48D2

2.2.3 各因素之间交互作用 图6～图8反映了固液比与溶液浓度、溶液浓度与保压时间、压力值与保压时间之间的交互作用。

图6 固液比、溶液浓度响应面图Fig.6 Response surface for effects of the solid-to-solution ratio and solution concentration on extraction rate of PLT

图7 溶液浓度、保压时间响应面图Fig.7 Response surface for effects of solution concentration and holding pressure time on extraction rate of PLT

图8 压力值、保压时间响应面图Fig.8 Response surface for effects of pressure value and holding pressure time on extraction rate of PLT

2.3 验证性实验

根据响应面模型得出最优化的条件如下：压力值为222.33MPa（取220MPa），保压时间3min，溶液浓度为56.31%（取56%），固液比为1∶25，经三次平行实验测得单宁得率为95.73%，与理论值96.19%接近。

2.4 超高压提取与溶剂提取对比

溶剂提取柿叶单宁结果与超高压提取结果对比，见表4。

从表4可以看出，超高压提取柿叶单宁，不仅耗时短，提取效果也明显高于溶剂提取。

表4 与溶剂提取方法比较Table 4 Compared with the solvent extraction method

3 结论

超高压提取柿叶单宁，耗时短并且得率高，是一种不错的选择。最佳的提取条件为：乙醇浓度56.31%，固液比1∶25（g∶mL），保压时间3min，压力值222.33MPa，理论得率可达到96.19%。

超高压作为新兴提取技术尚未得到广泛应用，超高压设备的技术革新也有待进一步发展，相信超高压加工技术的进一步提升，一定能给有效成分提取工业带来极大的帮助，也能为市场提供更多更好的新产品。

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Optimization of ultra high pressure extraction of persimmon leaf tannin by response surface method

LI Liang1，2，GU Shu-qin1，2，LU Da-xin1，*，YANG Dong1，2
（1.Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue，Beijing 102206，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）13-0273-04

2011－12－05 *通讯联系人

李亮（1984-），男，在读硕士，研究方向：农产品加工及贮藏工程。