PEG-（NH4）2SO4双水相提取蜂胶黄酮

毕玉芬，戴 云，雷 雨，丁仲娟，丁永真

（1.昆明医学院口腔医院，云南昆明 650021；2.云南民族大学，民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650521）

PEG-（NH4）2SO4双水相提取蜂胶黄酮

毕玉芬1，2，戴 云1，雷 雨1，丁仲娟2，*，丁永真1

（1.昆明医学院口腔医院，云南昆明 650021；2.云南民族大学，民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650521）

建立了PEG-（NH4）2SO4双水相提取蜂胶中总黄酮的方法，并利用CCD-RSM优化提取条件。在单因素实验基础上，考察PEG浓度、硫酸铵用量、pH 3个因素对蜂胶黄酮得率的影响。结果表明：最佳提取条件为：在PEG浓度为13.3%，pH为6.4，硫酸铵用量18.8%时，总黄酮提取率可以达到97.28%，该工艺具有价廉、简单快速、环境友好等优点。

蜂胶，双水相分离，总黄酮，响应面分析法，提取率

Abstract：The method of PEG-（NH4）2SO4two-phase system was built preliminarily to extract the total of flavonoids in propolis.The CCD-RSM was used to optimize the conditions.On base of single factor optimization，the PEG concentration，ammonium sulfate dosage and pH were investigated to detect the effect of flavonoids in propolis.The results showed that the optimal extraction conditions：PEG concentration 13.3%，and the pH6.4，ammonium sulphate content 18.8%，flavonoids extraction rate 97.28%.This method has many advantages，including priceless，simple，rapid and friendly to environment，etc.

Key words：propolis；two-aqueous phase；flavonoids；response surface methodology；extraction yield中图分类号：TS201.1 文献标识码：B 文章编号：1002-0306（2012）13-0205-04

双水相萃取技术（two-aqueous phase extraction，TAPE）是一种利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取的新型液-液萃取技术。TAPE法和传统的分离方法（如盐析、沉淀、有机溶剂萃取等）相比其优势在于实验设备简单、溶剂用量少3～10倍、不存在有机溶剂残留、分相时间短，且TAPE体系具有价廉、低毒、较易挥发而无需反萃取和避免使用粘稠水溶性高聚物等特点，因此近年来被广泛应用于生物化学、天然活性产物等领域[1-4]。星点设计（Central Composite Design，CCD）是在两水平析因的基础上增加极值点和中心点的实验条件设计方法[5]，响应面优化法（Response Surface Method，RSM）是通过对实验的各个水平因素进行连续分析，进而寻找最佳实验条件的方法[6-7]。蜂胶中富含的黄酮类物质具有多方面的生理与药理作用，因此引起了研究人员的广泛兴趣。目前国内对蜂胶黄酮的各种提取、分离分析方法已有许多报道[8-9]，但还未见到利用PEG-（NH4）2SO4双水相提取蜂胶中总黄酮并用CCD-RSM优化提取条件的方法报道。本文研究了聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取蜂胶总黄酮的方法，并利用CCD-RSM对提取条件进行了优化，以期为蜂胶资源的深入研究提供更多的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

云南产蜂胶 昆明医学院提供；芦丁标准品 购于中国药品生物制品检定所，批号10008；5%NaNO2溶液，10%Al（NO3）3溶液，4%NaOH溶液；所用试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

AS3120A超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；7200型可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；旋转蒸发仪 瑞士BUCHI；恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PEG-（NH4）2SO4双水相体系的形成[10]准确称取一定的PEG和硫酸铵于25mL比色管中，定容至刻度，确保溶液混合后分相，即得到25mL的PEG和硫酸铵双水相体系溶液。

1.2.2 蜂胶总黄酮的提取和测定

1.2.2.1 蜂胶样品制备 蜂胶原料脱蜡和粗提取参照文献[11]。浓缩，再准确称取一定质量配制成100mL溶液待用。

1.2.2.2 芦丁标准曲线绘制 参照文献[12]。

1.2.2.3 蜂胶总黄酮测定[13]准确移取一定浓度的蜂胶溶液，加入25mL PEG和硫酸铵双水相体系溶液，溶液充分混合，静止分相。总黄酮测定采用NaNO2-Al（NO3）3分光光度法，以芦丁为标准，在波长为510nm下测定。

1.2.2.4 蜂胶提取率计算[14]提取率测定按下式计算：

其中：R—双水相体系上下层的体积比；K—双水相体系的分配系数；Y—蜂胶在上层中的萃取率；Vu—上相体积，mL；Vd—下相体积，mL；Cu—上相物质质量浓度，mg/mL；Cd—下相物质质量浓度，mg/mL。

1.3 单因素实验

考察聚乙二醇浓度、硫酸铵用量、pH和温度4个因素对蜂胶总黄酮提取效果的影响。

1.4 编码设计[15]

本文选择聚乙二醇浓度、硫酸铵用量、pH作为本次实验的主要影响因子，设计响应面因素水平分布，如表1所示。

表1 因素水平设计表Table 1 Levels and factors of the experiment assignment

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 聚乙二醇浓度的确定 准确移取7份1.2.2.1制备蜂胶溶液各3mL，分别置于25mL比色管中，固定（NH4）2SO4浓度为16%，pH为7，聚乙二醇浓度变化范围为8%～18%，以2%为梯度变化，考察不同聚乙二醇浓度对蜂胶总黄酮提取效果的影响。

图1 不同PEG浓度对蜂胶总黄酮提取率的影响Fig.1 Different PEG concentration on the influence of flavonoids extraction from propolis

如图1所示，随着PEG浓度的增加，蜂胶总黄酮提取率逐渐增加，当PEG浓度达到12%时，蜂胶总黄酮提取率为最大值，当大于12%时，呈现下降趋势。故选择PEG浓度为12%。

2.1.2 硫酸铵用量的确定 准确移取5份1.2.2.1制备蜂胶溶液3mL，分别置于25mL比色管中，固定PEG6000浓度为12%，pH为7，硫酸铵用量范围为12%～20%，变化梯度2%，考察不同硫酸铵用量对蜂胶总黄酮提取效果的影响。

图2 不同硫酸铵用量对蜂胶总黄酮提取率的影响Fig.2 Different dosage of ammonium sulfate on the influence of flavonoids extraction from propolis

如图2所示，随硫酸铵用量的增大，蜂胶总黄酮提取率逐渐增大，硫酸铵用量为16%时，提取率最大。但用量超过16%后，反而使蜂胶总黄酮提取率下降。故硫酸铵用量为16%。

2.1.3 pH范围的确定 准确移取7份1.2.2.1制备蜂胶溶液3mL，分别置于25mL比色管中，固定PEG6000浓度12%，（NH4）2SO4浓度16%，pH变化范围为2～10，梯度为2，考察不同pH对蜂胶总黄酮提取效果的影响。

图3 不同pH对蜂胶总黄酮提取率的影响Fig.3 Different pH value on the influence of flavonoids extraction from propolis

如图3所示，随pH增加，蜂胶总黄酮提取率增大，但pH达到一定程度时，蜂胶总黄酮提取率最大。当pH为6时，蜂胶总黄酮提取率基本达到最大值。

2.1.4 温度的确定 准确移取4份1.2.2.1制备蜂胶溶液3mL，分别置于25mL比色管中，固定PEG6000浓度12%，（NH4）2SO4浓度16%，pH为7，考察温度在15、25、35、45℃时对蜂胶总黄酮提取的影响，结果表明：温度对实验过程影响不大，且考虑到该工艺是缓释药物制备的前期工作，故温度选择在室温下进行。此外，基于合作单位研究组考察后已确定选用PEG6000为载体，本研究组选择PEG6000为载体

2.2 实验设计与结果[16]

根据中心组合设计原理，以聚乙二醇浓度、硫酸铵用量、pH三个因素为自变量X1、X2、X3，总黄酮得率为响应值，设计了共20个实验点的响应面分析实验，其中14个析因点，6个零点，实验方案见表2。

2.3 回归模型

以蜂胶总黄酮的提取率为响应值，对各因素进行回归拟合，得到响应值Y和各因子之间的二次回归方程（R2=0.9995）：

Y=99.88-0.82X1-0.34X2-0.40X3-0.44X1X2+1.46X1X3-0.10X2X3-3.17X12-2.15X22-2.20X32

该方程p＜0.001，所以该模型是显著的，可用来预测聚乙二醇-硫酸铵双水相萃取体系提取蜂胶中总黄酮物质的最佳提取工艺。

表2 实验设计与结果Table 2 Experiment design and the results

2.4 方差分析

表3 响应面二次模型的方差分析结果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

表3中统计分析数据给出了线性项、二次项、以及交互项对蜂胶总黄酮提取率的影响，所有二次项以及交互项中，线性项和二次项的p值均小于0.001，说明影响差异极显著，二次项中，PEG浓度与硫酸铵用量的交互作用（p＜0.001）和硫酸铵用量与pH的交互作用（p＜0.001）对模型具有差异极显著性，而硫酸铵用量与pH的交互作用的p＜0.05，表现差异显著。

2.5 响应面分析

保持三个变量中的一个不变，得到PEG浓度、硫酸铵用量和pH之间其他两个因素之间的三维响应面曲线，见图4。

图4 各因素交互作用对总黄酮提取率影响的响应面图Fig.4 Response surface（3D）showing the effect of PEG concentration（X1），Ammonium Sulfate（X2）and pH（X3）on the response value of general flavonoids yield

图4a～c为PEG浓度X1、硫酸铵用量X2、pH范围X3对响应值云南产蜂胶提取率Y的响应图。由图a可看出，在X1、X2因素方向，取值相对较小时，响应面曲线明显较陡，说明X1、X2因素取值相对较小时对响应值Y蜂胶总黄酮提取率的贡献大；图b中，在X1、X3因素方向，取值相对较大时，响应面曲线明显较陡，表明取值相对较大时其相互间的交互作用对响应值Y蜂胶总黄酮提取率的影响大；图c表明，当X2、X3取值较小时，响应面曲线较陡，说明X2、X3取值较小时其相互间的交互作用对响应值Y的影响更大。综合考虑X1与X2和X3的交互作用（图a、b），X1值较大时对响应值Y蜂胶总黄酮提取率的贡献大；X2与X1和X3交互作用（图a、c），则X2值较大时对响应值Y蜂胶总黄酮提取率的贡献大；X3与X1和X2交互作用（图b、c），则X3值较小时对响应值Y蜂胶总黄酮提取率的贡献大。

结合显著性分析可知，在所选取的各因素水平范围内，按照对响应值Y的影响排序，3个因素对响应值Y的影响顺序是：X1（PEG浓度）＞X3（pH）＞X2（（NH4）2SO4用量），PEG浓度与（NH4）2SO4用量，PEG浓度与pH，（NH4）2SO4用量与pH对响应值蜂胶中总黄酮提取率Y存在交互作用，说明各因素对响应值的影响并非简单的线性加合关系。

2.6 条件优化及实验验证

利用Design-Expert Software 7.0的Optimization Choices模块，进行数字优化，可获得一组响应值最大的优化条件：PEG浓度为13.3%，pH为6.4，硫酸铵用量18.8%，总黄酮提取率为97.68%，参照理论上的优化条件进行验证实验，实验结果：提取率平均值Y=97.28%（n=5，R=0.16%），与理论提取率接近。

3 结论

本实验通过星点设计-响应面分析法优化实验条件，建立了用PEG-（NH4）2SO4双水相体系提取蜂胶粗物中总黄酮的方法，该方法设计简单，实验次数少，能充分考虑各因素间的相互作用，采用非线性数学模型拟合，复相关系数较高，与预测值基本相符，蜂胶总黄酮的提取率可达97.28%；该方法价廉低毒、简便易行，同时提高了蜂胶总黄酮得率，有较好的应用前景。

[1]郭宪厚，双水相萃取技术研究进展[J].广州化工，2008，36（5）：17-20.

[2]彭胜，彭密军，黄美娥，等.双水相体系萃取分离杜仲黄酮[J].中成药，2009，32（11）：1754-1757.

[3]董树国，赖红伟，陆钊.双水相萃取在黄酮类化合物分离分析中的应用[J].广州化工，2009，37（7）：43-44.

[4]双水相萃取法分离纯化黄酮类化合物的研究进展[J].应用化工，2010，39（10）：1587-1589.

[5]游海，陈芩，高荫榆，等.蜂胶黄酮类化合物提取工艺参数优化[J].食品科学，2002，23（8）：172-175.

[6]付英娟，于智峰，张建新.超声波提取蜂胶黄酮的条件优化[J].食品工业科技，2011，32（5）：143-146.

[7]阚欢，刘云，熊丽萍，等.响应面法优化罗望子胶的提取工艺[J].食品工业科技，2011，32（8）：321-324.

[8]陈静，王宏雁，王宁，等.响应曲面法优化蜂胶中的活性黄酮提取[J].应用化工，2011，40（10）：1753-1757.

[9]顾青，张燕萍，钟立人.蜂胶中有效成分提取工艺研究[J].浙江农业学报，2001，13（3）：161-164.

[10]高云涛，戴云，李世月，等.灯盏花素在丙醇-硫酸铵双水相体系中的分配行为研究[J].云南民族大学学报：自然科学版，2010，19（2）：106-109.

[11]赵娜，毕玉芬，李园，等.云南蜂胶中多酚化合物的HPLC分析研究[J].云南民族大学学报：自然科学版，2011，20（3）：209-212.

[12]周小理，王正，俞苓.蜂胶中黄酮类化合物的提取与测定[J].食品工业，2008，3（3）：17-20.

[13]郭亚键，范莉，王晓强，等．关于NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨[J]．药物分析杂志，2002，22（2）：97．

[14]赵爱丽，陈晓青，蒋新宇.应用双水相萃取法分离黄芩苷的研究[J].中成药，2008，30（4）：498-501.

[15]李东东，放茂良，刘琼，等.星点设计-响应面法优化超声提取青竹标多酚[J].中药材，2011，34（1）：129-133.

[16]章海燕，王立，张晖.基于响应面分析法优化的乌饭树树叶水溶性黄酮提取条件[J].食品工业科技，2010，31（3）：260-263.

Flavonoids extraction from propolis with PEG-（NH4）2SO4two-phase system

BI Yu-fen1，2，DAI Yun1，LEI Yu1，DING Zhong-juan2，*，DING Yong-zhen1
（1.The Affiliated Stomatology Hospital，Kunming Medical University，Kunming 650021，China；2.Key Laboratory of Ethnic Medicine Resources Chemistry，State Ethnic Affairs Commisson&Ministry of Education，School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650521，China）

2011－11－17 *通讯联系人

毕玉芬（1985－），女，在读研究生，研究方向：有机分析。

国家自然科学基金（30471225）；“十一五”国家科技支撑计划项目（2006BAD27B09；2006BAD04A12）；国家高技术研究发展计划项目（2007AA10Z320）。