指纹图谱技术在乳制品质量控制中的应用

樊 萍，张人明，贺武明，肖莲蓉，任国谱

（湖南亚华乳业有限公司，湖南长沙410200）

指纹图谱技术在乳制品质量控制中的应用

樊 萍，张人明，贺武明，肖莲蓉，任国谱*

（湖南亚华乳业有限公司，湖南长沙410200）

指纹图谱技术是一种分析复杂组分或成品的有效、全面的分析方法。简要地介绍了指纹图谱技术的特点、研究方法以及指纹图谱的构建。重点概述了指纹图谱技术在乳制品领域中的应用，包括特征鉴定、掺假识别、质量过程控制以及微生物监测四个方面。指纹图谱技术将成为乳制品质量控制新的发展方向。

乳制品，指纹图谱，质量控制，应用

Abstract：The technology of fingerprint is an effective means to analyze the complex components and products.The characteristics，the research methods and the construction theory of the fingerprint technology were introduced briefly.Application of fingerprint technology in dairy production was discussed emphatically，including flavor characterization，adulteration identification，and quality control of processing and monitoring of microbiology.Fingerprint Technology will be a new development for dairy production quality control.

Key words：dairy production；fingerprint；quality control；application

牛奶是婴幼儿早期除母乳外的唯一来源，其质量关系到孩子的生命安全。然而近年来，一些因奶粉质量问题而引发的事件层出不穷，如安徽阜阳的“毒奶粉”事件，“三聚氰胺奶粉事件”，圣元的“激素门”，以及最近的“皮革奶”等。因此，迫切需要生产企业建立有效的检测手段和有力的质量保障体系，提供更优质、安全、放心的乳制品。目前奶粉的鉴别方法主要有肉眼等感官鉴别法、化学分析法、中红外光谱分析法、紫外线吸收光谱法、近红外光谱分析法、超声波检测法等[1]。但是这些方法大多存在不足，一般只是测定乳制品中的单个组分或几个组分，不能将多个组分同时进行测定，难以从本质上、宏观上、整体上综合分析乳制品的质量。指纹图谱技术是一种快速、有效、全面的测定方法，强调的是图谱的完整面貌即整体性，反映的质量信息是综合性的。特别是在复杂体系中，指纹图谱能客观反映事物的全貌，是单一指标成分鉴定方法不可比拟的。不同地域的原料乳或不同厂家生产的乳制品都具有各自独特的风味组成以及所含菌落的差异性，以区别于其它产品，即有自己独一无二的“指纹特征”。本文借用中药、白酒、香料等成熟的指纹图谱技术，探索指纹图谱技术在乳制品质量控制中的应用。与单一成分作为控制指标的质量方法相比，指纹图谱可以很好地适应乳制品成分复杂的特点。指纹图谱技术不仅可以评价乳制品的真伪与优劣，也可以判断乳制品质量的稳定性以及制备工艺的合理性。

1 指纹图谱技术的特点

指纹图谱技术是指样品经适当的预处理后，采用一定的分析方法，得到能够显示该样品特性的谱图，这些图谱就像人的指纹一样具有专一性和代表性，且尽可能多地反映样品的全貌，所以被称之为指纹图谱。

其特点在于：特征性和专属性：通过指纹图谱能有效鉴别样品的真伪或产地；可量化性：由主要特征峰的面积或比例，能有效控制样品质量，确保样品质量的相对稳定；稳定性、重现性和再现性：由图谱采集环境或者分析测试手段决定；有效性：这应与产品相联系，并且在统计学上其数据有鉴别意义；完整性：表现多成分之间的相互关系；模糊性：成分间的协同交互作用复杂，故采用模糊数学的分析手段解决实际问题[2]。

2 指纹图谱技术的研究方法

指纹图谱技术的研究方法主要包括：色谱法：传统的薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法和高效毛细管电泳法等；光谱法：紫外光谱法和红外光谱法等；波谱法：质谱法和核磁共振法等；其他方法：如X射线衍射法，分子生物学方法等[3]。其中色谱法是公认的应用最广也是最成熟的指纹图谱技术的研究方法。

气相色谱法（GC）主要用于分析气体、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸汽压的固体，或者沸点在500℃以下，相对分子质量400u以下的物质。GC的特点是灵敏度高、分离度好、分析速度快[4]。

高效液相色谱法（HPLC）是一种具有高灵敏度、高选择性、高效、快速的分离分析技术。它给出的是高分辨率的轮廓图谱，重现性好、操作相对容易、在线操作外界影响因素小、色谱稳定性好，是目前指纹图谱研究应用最多的一项技术[5]。

DNA指纹图谱技术属于分子生物学方法的范畴，可用于鉴别产品的真伪。由于同种生物体具有相同的DNA序列，生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异，可依据此来鉴定生物物种。随着微量DNA提取技术和PCR扩增、RAPD随机扩增标记技术的发展，使DNA的提取更加便捷准确。在分子水平上检测基因多态性，比形态、组织和化学水平上检测结果更加准确可靠。

3 指纹图谱的构建

指纹图谱的构建步骤为：

a.样品采集：考虑到样品批次不同所导致的差异，要在一定数量的样品中，选择合适数量的样品进行检测。一般要求至少六个批次的标准样品进行检测，把获取的原始图谱（图像）进行平均，得出标准图谱[6]。

b.图谱数据的采集：样品经过或不经过预处理，选取适当的方法建立指纹图谱，进一步确定该方法所对应的各项参数。例如，采用色谱法进行指纹图谱分析，则要确定进样方式和进样量以及所使用的色谱条件，包括色谱柱的选择、载气、温度、流速、质谱条件等[7]。

c.数据分析：对获得的图谱进行比较分析，寻找分离好、分辨率高、重现性好的图谱，进行图谱辨认和评价，找出具有规律性的“共性”和“个性”。常用的数据分析方法有：直观比较法、量化数据比较法、化学模式识别法、计算机软件分析等[8]。

4 指纹图谱技术在乳制品中的应用

4.1 特征鉴定

不同区域的原料乳或不同品牌的乳制品，由于地理分布、气候条件等环境因素的不同和地域文化特征的差异，其中所含挥发性物质的含量和比例以及所含菌落的多样性和差异性也不尽相同。它们的指纹图谱会表现出相同的特征，也就是共性部分，当然也会有部分指纹图谱的表现不同，这就是决定原料乳或成品独有的个性部分，需经鉴别系统进行进一步的识别。不同的地区或不同的奶源基地可以建立各地收奶地区的指纹图谱库，以表现不同的地方特色，而且不同产地的原料乳或成品将组成全国的乳制品指纹图谱库。

据报道采用固相微萃取-气相色谱-顶空-质谱（SPME-GC-HS-MS）法，不经前处理，可直接对奶油进行分析，其质量指纹图谱既可用于鉴别进口新西兰天然奶油，也可用于鉴别不同生产国所生产的天然奶油[9]。

C Fernandez等人分别于春夏冬三季在法国的高原地带（奥弗涅山脉）和较低地区（布列塔尼半岛）共收集有代表性的原料乳样品35个。乳脂肪中提取的单萜烯类和倍半萜类物质采用顶空气质联用法定量，通过多因辨别分析将原料乳样品分类。发现奥弗涅高地的原料乳较布列塔尼半岛含有更多的倍半萜，全部样本按照原产地域正确归类，不受其季节性畜群管理模式的影响。根据地域范围和生产条件，通过萜烯混合物可以得到有价值的乳制品特征指纹图谱[10]。

I Bonizzi等人通过16S-23S ITS-PCR技术，建立了高山牧场、低地牧场所产原料乳中微生物群落的指纹图谱，该指纹图谱可表现生物多样的特征。结果表明生产意大利干酪的阿尔卑斯山地区的原料乳包含了各种各样的细菌群落，而细菌群落的组成与牧场的海拔有关[11]。

4.2 掺假识别

部分奶农或奶站为牟取暴利，添加三聚氰胺、皮革蛋白等以次充好，以假乱真，利用指纹图谱技术可以有效打击乳制品的制假售假。首先，根据季节等外界因素的不同，选取足够多的样本，以其出峰的先后顺序及相对含量的多少为特征，建立本地区稳定的原料乳基础指纹图谱库；其次，以基础指纹图谱库为参照，将被鉴别的样本指纹图谱与基础指纹图谱库进行对比，根据出峰数量、保留时间、峰形大小等参数对图谱进行定性识别，寻找是否存在差异的未知峰；最后，参数吻合则为合格，如果存在差异峰则需进一步的深入研究，选取合适的内标物应用质谱将未知峰定性。

曾庆方等人通过建立牛奶的HPLC-MS指纹图谱，提取原料奶的特征信息，在样品分析后的特征信息中扣除本底数据库中已有的参考值，对异常参数值进行分析、确证，找出异常化合物。HPLC-MS指纹图谱技术应用于牛奶中有害药物筛查，较之用单一成分或指标监控，其质量更具有科学性、全面性和可追溯性，也从根本上解决了其他现有分析技术必须多种方法结合使用以及多项指标必须同时检测才能对其质量合格与否做出判断的弊端，大大提高了质量控制和评价的技术水平和科技含量[12]。

王颜红等人采用高效液相色谱质谱联用技术，建立了原料奶指纹图谱，在一定程度上客观反映了原料奶的整体质量特征。在此基础上，选取有代表性有害物如防腐剂苯甲酸等进行了标准添加，建立了危害物的标准添加图谱，对沈阳地区超市的50个纯牛奶样品进行了筛查，取得初步应用结果，为原料奶的质量控制和奶制品中有害物筛查体系的研究提供了方法学参考[13]。

4.3 质量的过程控制

在保证了上游奶源质量安全的基础上，指纹图谱技术同样也可以应用在乳制品质量过程控制和出厂检验。指纹图谱的特征可以反映半成品或成品内在质量的均一性和稳定性，又能表现各批次间的差异性，是判定原辅料及产成品质量稳定的重要手段。因此，乳制品生产企业可以建立自己的指纹图谱数据库，以此来指导生产、优化工艺、降低成本、实现利润最大化。

袁洁等人认为指纹图谱相似度是利用色谱流出曲线中保留时间对色谱峰进行匹配，然后对匹配峰进行比值计算，综合计算出图谱之间的相似度，从而实现对样品差异程度的评价。既可评价产品批次间的稳定性，又可评价产品之间的差异性，具有直观、全面的优点[14]。

I Proudy等人收集并归类了200个分离的阪崎肠杆菌，其中70%表现出相同的指纹图谱，表示在生产环境中有阪崎肠杆菌的存在。此方法可用于发现干混营养素方法生产的婴儿配方奶粉中微生物的污染，同时，可实现一系列其他的控制管理，以减少最终产品受阪崎肠杆菌的污染[15]。

J Banykó等人采用PCR分析提取分离的芽孢杆菌，单引物定向扩增各物种的box重复序列作为特征序列，生乳和巴氏杀菌乳中所被污染的蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌种不同，而且乳制品生产过程中存在的一些BOX类型在原料乳中却没有。BOX-PCR指纹图谱技术可以表征乳制品生产环境中杆菌的菌群，因此可用作证实环境是否被污染以及牛奶生产过程中杆菌的繁殖[16]。

4.4 微生物的检测

通过指纹图谱技术检测乳制品中的乳酸菌，可实现乳酸菌组成及浓度的实时监测，进而反映产品质量的稳定性。此外，原料乳及乳制品在加工、运输和流通等环节都有可能受到杂菌的污染，应用指纹图谱技术可鉴定有害微生物菌种的组成、预测环境微生物可能存在的污染风险等。

李武等人利用PCR-DGGE指纹图谱技术对市售某品牌酸奶进行了一个月的动态监测，共收集了6个生产批次的18个酸奶样品，结合常规分离培养方法，对样品微生物组成及其稳定性进行跟踪监测。结果显示所有供试样品在整个动态监测期内DGGE指纹图谱都出现2条带，其微生物组成比较稳定，分别为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。通过菌种组成及其稳定性两个指标对酸奶样品质量进行评价，该技术可以作为酸奶质量控制和动态监测的快速、简便的新方法[17]。

靳淼等人对引进直投型酸奶发酵剂（DVS）中乳杆菌进行分离鉴定，利用MRS半选择性培养基对其进行分离，采用糖发酵实验、全细胞蛋白电泳和RAPD指纹图谱三种方法对其鉴定。结果表明，引进直投型酸奶发酵剂中乳杆菌由两株菌构成[18]。

B E Gillespie等人使用聚合酶链反应为基础的DNA指纹图谱技术，将美国田纳西州和新西兰的牛乳房分泌物中分离出的停乳链球菌和乳房链球菌进行分类。数据表明新西兰的停乳链球菌和乳房链球菌与美国田纳西州截然不同，认为DNA指纹图谱技术可以作为一个流行病学的工具，用来区分链球菌，同时可以鉴定农场中乳腺炎病原菌的来源[19]。

Robin M等人研究了脱脂乳粉、婴儿配方奶粉、卵磷脂、可可粉等食品，每种食品的PCR指纹图谱经过电泳分析，该谱带与产肠毒素的芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的DNA指纹图谱有关。利用rep-PCR得到的DNA指纹图谱不仅是确定细菌基因类型的工具，也是食品微生物学中质量控制和卫生监测的独特方法[20]。

5 应用前景

随着人们生活水平的提高，乳制品已经走进了千家万户，以其营养丰富、口味独特、品种多样等特点吸引着越来越多的消费者。面对如此庞大的乳制品消费市场，保证乳制品质量安全显得非常重要。指纹图谱技术对于乳制品这种特殊复杂的物质来说，可以实现多组分、多指标同时测定，在特征的鉴定，掺假的鉴别，质量的过程控制等方面应用较广，真正实现从原料、配方到生产工艺及产成品全方位的稳定、可控。指纹图谱技术在乳制品中的应用研究虽然起步较晚，但是从长远来看，其将成为乳制品质量控制新的发展方向。

[1]单至学.牛奶成分分析方法浅谈[J].广西质量监督导报，2009（2）：72-73.

[2]陈私，郭勇，王智猛，等.指纹图谱用于白酒质量的控制[J].化学研究与应用，2004（6）：373-374.

[3]刘小瑜，吕圭源，俞景华.指纹图谱在中药研究中的应用概况[J].天津药学，2006（1）：46-47.

[4]唐兴刚，李雪，李盛强.中药指纹图谱的研究进展[J].中国兽医杂志，2010（6）：62-64.

[5]王乐，李素霞，陈晶.中药指纹图谱在中药质量控制中的应用[J].河北工业，2010（1）：71-73.

[6]王钧，赵曰利.色谱指纹图谱对香精香料质量控制的研究[J].中国测试技术，2005（3）：45-46.

[7]袁洁，尹京苑，高海燕.指纹图谱在白酒中的应用研究进展[J].食品科学，2008，29：680-684.

[8]曲国福，孟昭宇，陆舍铭.香料指纹图谱及其在烟用香精质量控制中的应用概述[J].烟草科技，2000（5）：47-50.

[9]朱潘炜，刘东红，黄伟，等.指纹图谱技术在食品品质检测中的应用[J].粮油加工，2008（6）：125-128.

[10]C Fernandez，C Astier，E Rock，et al.Characterization of milk by analysis of its terpene fractions[J].International Journal of Food Science&Technology，2003（4）：445-451.

[11]I Bonizzi，J N Buffoni，M Feligini，et al.Investigating the relationship between raw milk bacterial composition，as described by intergenic transcribed spacer-PCR fingerprinting，and pasture altitude[J].Journal of Applied Microbiology，2009，10：1319-1329.

[12]曾庆方，赵春杰，王颜红，等.HPLC-MS指纹图谱用于牛奶中部分有害药物的筛查研究[J].中南药学，2010，8（2）：412-416.

[13]王颜红，张红，林桂凤，等.原料奶的高效液相色谱指纹图谱的建立[J].色谱，2010，10：935-939.

[14]袁洁，尹京苑，高海燕.指纹图谱在白酒中的应用研究进展[J].食品科学，2008，29：680-684.

[15]I Proudy，D Bouglé，R Leclercq，et al.Tracing of Enterobacter sakazakii isolates in infant milk formula processing by BOXPCR genotyping[J].Journal of Applied Microbiology，2008（8）：550-558.

[16]J Banykó，M Vyletělová.Determining the source of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis isolated from raw milk，pasteurized milk and yoghurt[J].Letters in Applied Microbiology，2009（3）：318-323.

[17]李武，王凌华，张晓君，等.一种快速的酸奶质量跟踪监测检验新方法[J].中国乳业，2005（9）：44-47.

[18]靳淼，高学军，雷蕾.引进直投型酸奶发酵剂乳杆菌的分离鉴定[J].中国乳品工业，2003（4）：14-16.

[19]B E Gillespie，B M Jayarao，J W Pankey，et al.Subtyping of Streptococcus dysgalactiae and Streptococcus uberis isolated from bovine mammary secretions by DNA fingerprinting[J].Journal of Veterinary Medicine，1998，11：585-593.

[20]Robin M Cooper，John L Mc Killip.Enterotoxigenic Bacillus spp.DNA fingerprint revealed in naturally contaminated nonfat dry milk powder using rep-PCR[J].Journal of Basic Microbiology，2006，10：358-364.

Application of fingerprint technology in dairy production quality control

FAN Ping，ZHANG Ren-ming，HE Wu-ming，XIAO Lian-rong，REN Guo-pu*
（Hunan AVA Dairy CO.，Ltd.，Changsha 410200，China）

TS252.1

A

1002-0306（2012）13-0417-04

2011－05－18 *通讯联系人

樊萍（1982-），女，硕士研究生，助理工程师，研究方向：农产品加工与储藏。

长沙市重大专项（K1003191-21）。