传统鱼制品中优良葡萄球菌的筛选与鉴定

张琦琳，林胜利，聂小华

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

传统鱼制品中优良葡萄球菌的筛选与鉴定

张琦琳，林胜利，聂小华*

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

从盐干鱼及糟腌鱼中分离纯化得到158株葡萄球菌，按照肉制品发酵剂筛选标准，获得3株优良葡萄球菌S8、S61和S92，其具有良好的生长特性及耐盐性。经梅里埃VITEK-2全自动微生物系统鉴定及16S rDNA序列分析，优良葡萄球菌S8、S61和S92分别为沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

传统鱼制品，葡萄球菌，筛选，鉴定

Abstract：According to the standards of meat fermentation starter，three Staphylococcus strains（S8，S61 and S92）with excellent characteristics were isolated and screened from traditional fish products.And the results of BioMerieux VITEK-2 automation microbe system and 16S rDNA sequence analysis showed that they were Staphylococcus warner，Staphylococcus sciuri and Staphylococcus xylosus respectively.

Key words：traditional fish products；Staphylococcus；screening；identification

大量研究结果表明，葡萄球菌在发酵制品的风味形成中发挥着重要作用，近年来逐步成为国内外传统食品的研究热点。已有研究发现，葡萄球菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，对脂肪自动氧化引起的酸败及由过氧化氢酶导致的褪色具有良好的抑制作用，同时其分泌的蛋白酶和脂肪酶可促进发酵食品中特殊风味的形成与积累，有效改善产品品质[1-3]。Asiedu M[4]等人从非洲西部的一种自然发酵鱼肠Enam Ne-Setaakye中成功分离出葡萄球菌。Fukami K[5-6]等人从日本鲭鱼鱼露中成功分离出木糖葡萄球菌，并将其应用于泰国鱼露发酵，显著提高了鱼露的风味。Anihouvi VB[7]等人从发酵木薯鱼中分离出芽孢杆菌、葡萄球菌、微球菌、链球菌、假单胞菌等，其中芽孢杆菌和葡萄球菌为优势菌株，分别占分离菌株总数的48.7%和27.3%，并且已证明其拥有适度的蛋白酶和脂肪酶活力。Tremonte P[8]等人将葡萄球菌、玫瑰微球菌联合乳酸菌发酵培养，研究表明葡萄球菌、玫瑰微球菌不但可促进乳酸菌的生长，还可以增强菌株的蛋白水解活性。本实验以盐干鱼、糟腌鱼等传统鱼制品为原料，依据肉制品发酵剂的筛选标准，对其制品中葡萄球菌进行分离纯化，以期得到适合生产发酵鱼肉制品的优良菌株，为进一步探讨葡萄球菌在鱼制品的应用奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

盐干鱼和糟腌鱼 实验室自制；MSA培养基 蛋白胨10g，牛肉膏1g，D-甘露醇10g，氯化钠75g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.6，121℃，灭菌20min，MSA固体培养基在此基础上添加18g/L的琼脂；耐盐性实验培养基MSA液体培养基分别添加3%、6%、9%和12%的NaCl；产H2S培养基（醋酸铅纸条法） 蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏10g，半胱氨酸0.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4，112℃，灭菌20～30min。另将普通滤纸剪成0.5～1cm宽的纸条，用5%～10%的醋酸铅溶液将纸条浸透后烘干，置于培养皿中灭菌备用；葡萄糖产气培养基 MSA液体培养基，加入倒置的杜氏小管，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.625mL，121℃灭菌20min，配制时先将蛋白胨加热溶解，调pH后加入溴甲酚紫，再加入葡萄糖；氨基酸脱羧酶培养基 蛋白胨5g，酵母提取物3g，葡萄糖1g，蒸馏水1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，L-氨基酸5g或DL-氨基酸10g，pH6.8；石蕊牛奶培养基10g脱脂奶粉溶解于100mL水中，再加入4mL浓度为25g/L的石蕊，分装试管，113℃灭菌15min；蛋白酶检测培养基 以MSA固体培养基为基础添加15%脱脂奶粉；脂肪酶检测培养基 以MSA固体培养基为基础添加15%的牛油及中性红指示剂。

超净操作台、YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌锅、SPX-250B-Z型恒温生化培养箱、GX-9070-MBE型恒温鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司；SP-75紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；SKY-200B震荡培养箱 上海苏坤实业有限公司；Phs-3C型数字酸度计 杭州东星仪器设备厂；85-2数显恒温定时磁力搅拌器 杭州仪表电机有限公司；BS/BT4202S型Sartorious电子天平 赛多利斯公司；PCR仪 美国BIO-RAD。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄球菌的分离纯化 无菌条件下，取盐干鱼、糟腌鱼各10g，分别置于90mL无菌生理盐水中匀浆并进行梯度稀释，选取2～3个适合稀释梯度，采用MSA培养基倾注平板，30℃培养24h。随机挑选单一菌落，平板划线进行分离，得到158株单一菌株[4]。

1.2.2 优良葡萄球菌的筛选 将分离得到的单一菌株进行革兰氏染色，过氧化氢酶活性检测，溶菌酶、溶葡萄球菌素、呋喃唑酮、杆菌肽敏感性实验，得葡萄球菌疑似菌株。在此基础上进一步进行凝固酶实验、溶血实验、产粘实验、葡萄糖产气实验、产H2O2实验、氨基酸脱羧酶实验、产氨实验、产H2S实验[9-10]、蛋白酶活性[11-12]及脂肪酶活性[12]检测完成菌株的筛选。

1.2.3 生长曲线的测定 将筛选所得菌株接种于MSA液体培养基，于30℃、150r/min下培养，每隔2h取样一次，于680nm测定OD值，以未接菌的MSA液体培养基为空白对照液。

1.2.4 耐盐性实验 将筛选所得菌株接种到分别添加有0%、3%、6%、9%、12%NaCl的MSA液体培养基中，于30℃、150r/min下培养24h，以未接菌的MSA液体培养基作为空白对照液，于680nm测定OD值。

1.2.5 梅里埃VITEK-2系统鉴定 待测菌株经纯培养后，采用法国梅里埃生物公司革兰氏阳性鉴定卡，VITEK-2全自动微生物鉴定分析系统进行鉴定，严格按照操作说明进行操作。

1.2.6 16S rDNA的PCR扩增及序列分析 将筛选所得菌株接种至MSA固体培养基中，于30℃下培养24h。应用一对通用引物（正向引物16S rDNA-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物16S rDNAR：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3）以基因组DNA为模板PCR扩增16S rDNA基因[13]。

PCR反应体系（50μL）：引物16S rDNA-F和16S rDNA-R各1.5μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTP（2.5mmol/L）3μL，Taq酶（5U/μL）1μL，重蒸水38μL。灭菌牙签挑取适量菌体，加入反应体系内。

PCR程序设置如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，经35个循环后72℃延伸10min。

PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送交上海INVITROGEN公司进行测序，测得序列与NCBI数据库中已知序列进行比对及相似性分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄球菌的分离及筛选

采用MSA培养基，从盐干鱼和糟腌鱼中分离纯化得158株单一菌株，其中革兰氏阳性、球状、H2O2酶阳性、溶葡萄球菌素和呋喃唑酮敏感、溶菌酶和杆菌肽不敏感的葡萄球菌疑似菌126株。依据肉制品发酵剂筛选标准，筛选出能够耐受6%NaCl、发酵蔗糖不产粘、发酵葡萄糖不产气、不产H2O2、不产H2S、不产氨、不具有氨基酸脱羧酶活性及凝固酶反应阴性、溶血实验阴性，同时具备良好的蛋白酶及脂肪酶活力的优良葡萄球菌株3株（S8、S61及S92），如表1。

表1 筛选葡萄球菌菌体形态及生理生化实验结果Table 1 Results of mycelia morphology and physiological biochemical test

2.2 优良葡萄球菌的生长特性

2.2.1 生长曲线 将筛选得到的3株优良葡萄球菌进行液体培养，分析其生长情况，如图1所示。由图可知，优良葡萄球菌S8、S61和S92表现出相似的生长趋势，皆从4h后进入对数生长期，18h后进入生长平稳期，这表明筛选得到的三株优良葡萄球菌均具备良好的生长特性。菌液OD值在0～1.0范围内存在线性关系，当测定值超出线性范围，则应稀释适当比例后再进行测定，经换算最终确定菌液OD值。

图1 优良葡萄球菌的生长曲线Fig.1 The growth curve of the excellent Staphylococcus

2.2.2 耐盐性实验 发酵肉制品加工过程中，食盐具有调味、防腐保鲜及提高持水能力等作用。研究发现一定浓度的食盐可抑制腐败菌的生长，同时对发酵菌株也会产生一定的影响，因此一般要求发酵菌株耐盐性可达6%[14]。

耐盐性实验（图2）表明，NaCl含量对葡萄球菌的生长有着不同程度的影响，其中优良葡萄球菌S8、S61和S92在3%～6%NaCl含量的MSA培养液中生长较为旺盛，此后随着NaCl浓度的增加，其生长情况均受到不同程度的抑制，但在含有12%NaCl含量的培养液中仍可生长，培养液OD值依然保留在0.6～1.0之间，这说明优良葡萄球菌S8、S61和S92具有较强的耐盐性。

图2 优良葡萄球菌的耐盐性Fig.2 The salt tolerance of the excellent Staphylococcus

2.3 优良葡萄球菌的鉴定

2.3.1 梅里埃VITEK-2系统鉴定结果 根据梅里埃VITEK-2系统鉴定结果分析（表2），优良葡萄球菌S8可能为沃氏葡萄球菌，其匹配度为96%；优良葡萄球菌S61可能为松鼠葡萄球菌，其匹配度为95%；优良葡萄球菌S92可能为木糖葡萄球菌，其匹配度为99%。

图3 待测菌株PCR扩增16S rDNA凝胶电泳图Fig.3 The electrophoretogram of PCR-amplification of 16S rDNA from the strains

表2 梅里埃VITEK-2鉴定结果Table 2 Identification results by VITEKⅡsystem

2.3.2 16S rDNA分析及系统发育树的构建 用1%琼脂糖凝胶对优良葡萄球菌S8、S61和S92的16S rDNA扩增产物进行电泳检测，经溴乙锭染色后，三者均在1500bp左右出现荧光条带，与预期结果一致（如图3）。将PCR产物送交上海INVITROGEN公司进行序列测定，测得优良葡萄球菌S8、S61和S92的序列长度分别为1460、1472、1452bp。PCR产物测得序列采用软件DNAStar、Clustalx与GenBank数据库中的参考序列进行Blast同源性比对，并应用MEGA4.1软件的邻位相连（Neighbor-joining）法构建系统发育树（如图4）。结果表明，优良葡萄球菌S8、S61和S92的遗传进化分别与已知沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri G7，Staphylococcus warneriR-38534，Staphylococcus warneri R-36520）、已知松鼠葡萄球菌（StaphylococcussciuriDSM 20345，StaphylococcussciuriCTSP9，Staphylococcus sciuri R10-5A）和已知木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus AF515587，Staphylococcus xylosus AY395016，Staphylococcus xylosus 741）同处于一个最小分支，同源性高达99%～100%。

结合梅里埃VITEK-2全自动微生物系统鉴定结果，进一步确定优良葡萄球菌S8为沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），S61为松鼠葡萄球菌（Staphylococcussciuri），S92为木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

图4 优良葡萄球菌S8、S61、S92的系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of excellent strains S8，S61，S92

3 结论

3.1 从盐干鱼和糟腌鱼中筛选得到三株优良葡萄球菌（S8、S61和S92），具有较好的蛋白酶活性和脂肪酶活性，且表现出良好的生长特性和耐盐性。

3.2 根据菌株形态特征、梅里埃VITEK-2全自动微生物系统鉴定结果及16S rDNA序列测定综合分析，葡萄球菌S8、S61和S92分别为沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

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Screening and identification of Staphy/ococcus from traditional fish products

ZHANG Qi-lin，LIN Sheng-li，NIE Xiao-hua*
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

TS254.1

A

1002-0306（2012）13-0178-04

2011－09－29 *通讯联系人

张琦琳（1985-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

国家863专题项目（2007AA09z442）。