高迁移率族蛋白B1与急性胰腺炎肠黏膜屏障损伤关系的研究*

张伟杰 徐桂芳 田志强 吴国忠 邹晓平#

南京大学医学院附属鼓楼医院急诊科1(210008) 消化科2 中国人民解放军第101医院普外科3

高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是一种高度保守的DNA结合蛋白，主要由巨噬细胞、单核细胞在炎症因子的刺激下主动释放，亦可由坏死细胞被动释放，与炎症反应关系密切［1］。近年研究［2］显示 HMGB1在坏死型急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)大鼠肠黏膜屏障损伤过程中发挥重要作用。对于HMGB1在临床实践中的应用价值，目前尚缺乏深入研究。本研究通过观察AP患者的血清HMGB1含量及其与血清内毒素含量、二胺氧化酶(DAO)含量、尿液乳果糖/甘露醇(L/M)比值等肠黏膜屏障功能相关指标的关系，分析HMGB1在AP患者肠黏膜屏障损伤中的作用。

对象与方法

一、研究对象

纳入2007年12月～2009年3月南京大学医学院附属鼓楼医院和中国人民解放军第101医院收治、确诊的AP患者80例。根据我国2007年重症急性胰腺炎(SAP)诊治指南［3］将患者分为SAP组和轻症急性胰腺炎(MAP)组。SAP组患者38例，其中男18例，女20例，年龄23～89岁，平均(51.7±15.7)岁;MAP组患者42例，其中男26例，女16例，年龄19～80岁，平均(37.3±17.8)岁。排除标准:①入院后1 d内死于复苏失败者;②结缔组织病患者;③肿瘤患者;④合并其他可能影响HMGB1水平疾病者。患者入院后接受抑酶、抑酸、抗感染等常规治疗。选取30名同期健康体检者作为正常对照组，其中男16名，女14名，年龄21～69岁，平均(41.6±10.3)岁。研究方案经南京大学医学院附属鼓楼医院和中国人民解放军第101医院伦理委员会批准，所有入组受检者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.血清HMGB1含量测定:所有入组患者在起病72 h内采集外周血标本5 mL，标本采集后3 h内分离血清并于－20℃保存待测。人HMGB1 ELISA试剂盒为日本SHINO-TEST公司产品，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

2.血清内毒素含量测定:内毒素鲎试剂盒为上海伊华医学科技有限公司产品。在16孔板中分别加入50 μL去内毒素水，将标准品按1∶3比例稀释使之浓度达到3 ng/mL，在第一孔内加入25 μL稀释标准品，充分混匀，再从第一孔内吸出25 μL加入第二孔，依次稀释至第七孔。从第七孔内吸出25 μL弃去，第八孔作为空白对照。同时做复管，于405 nm波长处测定吸光度(A)值，绘制标准曲线。每孔内加入50 μL血清样品和50 μL鲎试剂，室温孵育30～45 min，加入50 μL终止液。于405 nm波长处测定 A值，从标准曲线中得到相应内毒素浓度。

3.血清DAO含量测定:人DAO ELISA试剂盒购自上海阳光生物科技有限公司。血清样品于37℃孵育30 min，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液3 mL、辣根过氧化物酶0.1 mL(4 μg)、邻联二茴香胺甲醇0.1 mL(500 μg)、盐酸腐胺 0.1 mL(157 μg)，标准管中加DAO标准品3.8 mL，磷酸盐缓冲液3.8 mL CT作空白对照，于436 nm波长处测定血清DAO含量。

4.尿液L/M比值测定:采用离子色谱法，乳果糖和甘露醇标准品为美国Sigma公司产品。受检者空腹8 h，予2 g乳果糖和1 g甘露醇口服，收集6 h尿液，取其中20 mL于－20℃保存待测。取待测尿液样品5 mL，离心10 min取上清，以去离子水将标本稀释100～200倍，加入1 g阳离子交换树脂中去除离子。滤液经孔径为0.22 μm的滤膜去除蛋白和颗粒后，取25 μL注入高压液相离子色谱仪，使用配套软件对色谱图形进行积分处理，测得峰面积，并建立乳果糖和甘露醇的标准计算公式，计算出样品中的乳果糖和甘露醇浓度、排出率、L/M比值。

5.AP病情严重程度评估:根据相应标准评估入组患者的Ranson评分、24 h APACHEⅡ评分和Balthazar CT评分。

三、统计学分析

结 果

一、血清HMGB1含量

SAP组和MAP组血清HMGB1含量与对照组相比明显升高，且SAP组明显高于MAP组，差异均有统计学意义(见表1)。

二、血清内毒素含量、DAO含量和尿液 L/M比值

SAP组和MAP组血清内毒素含量、DAO含量和尿液L/M比值与对照组相比明显升高，且SAP组明显高于MAP组，差异均有统计学意义(见表1)。

三、血清HMGB1含量与AP严重程度的相关性

线性相关分析显示，80例AP患者血清HMGB1含量与Ranson评分、24 h APACHEⅡ评分、BalthazarCT评分均呈正相关(r1=0.690，r2=0.840，r3=0.738，P ＜0.001)(见图1)。

表1 各组血清HMGB1、内毒素、DAO含量和尿液L/M比值比较()

表1 各组血清HMGB1、内毒素、DAO含量和尿液L/M比值比较()

*与 SAP组比较，P ＜0.05;#与 MAP组比较，P ＜0.05

组 别 例数 HMGB1(μg/L) 内毒素(EU/L) DAO(U/L) L/M 比值SAP 组 38 11.79 ±3.98 0.77 ±0.26 18.36 ±6.39 0.39 ±0.26 MAP 组 42 5.38 ±2.06* 0.59 ±0.16* 9.79 ±4.26* 0.18 ±0.19*对照组 30 1.87 ±1.47*# 0.05 ±0.01*# 2.27 ±0.67*# 0.03 ±0.01*#

四、血清HMGB1含量与血清内毒素含量、DAO含量和L/M比值的相关性

线性相关分析显示，80例AP患者血清HMGB1含量与血清内毒素含量、DAO含量、尿液L/M比值均呈正相关(r1=0.634，r2=0.692，r3=0.686，P＜0.001)(见图2)。以 HMGB1为自变量，以内毒素、DAO、L/M为应变量行直线回归，得出HMGB1含量与内毒素含量、DAO含量、L/M比值之间存在线性依存关系(b1=0.366，b2=0.287，b3=0.354，P ＜0.05)。

讨 论

AP是临床常见的急腹症，肠黏膜屏障损伤引起继发感染是AP患者死亡的主要原因之一。研究［4］发现，SAP患者早期即存在肠道通透性改变，肠道细菌通过肠黏膜屏障易位至胰腺及其周围脏器，导致多器官功能衰竭综合征(MODS)，并释放内毒素进入血循环，继发全身性脓毒血症。Liu等［5］的研究发现，AP患者血清内毒素水平较正常人明显升高，升高程度与肠道通透性呈正相关。DAO是存在于小肠黏膜上皮细胞内的高活性结构酶，肠黏膜上皮细胞损伤时释放入血，其在血液中的含量可反映肠黏膜上皮细胞的损伤程度。甘露醇和乳果糖在生理情况下不被机体代谢，主要以原形从尿液排出。乳果糖由肠黏膜细胞间的紧密连接透过肠黏膜，而甘露醇由肠黏膜细胞膜上的水溶性微孔透过肠黏膜。如肠黏膜细胞间紧密连接受损、细胞间隙增大，则乳果糖吸收增加，甘露醇则无明显变化，因此尿液L/M比值可反映肠黏膜损伤程度［6，7］。本研究发现，SAP和MAP组患者血清内毒素含量、DAO含量、尿液L/M比值与正常对照组相比均显著升高，提示SAP和MAP患者肠黏膜受损，黏膜屏障通透性增高。

图1 血清HMGB1含量与AP严重程度的相关性

图2 血清HMGB1含量与肠黏膜屏障功能相关指标的相关性

HMGB1是一种存在于细胞核内的非组蛋白核蛋白，具有晚期炎症因子的作用，可介导持续性炎症反应，并参与 DNA 的转录、复制、修复等［1，8］。Luan等［2］的研究表明，AP大鼠肠黏膜中HMGB1含量明显升高，并伴有内毒素、DAO、髓过氧化物酶(MPO)含量升高。Sappington等［9］的研究表明，HMGB1通过诱导诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达促进NO合成，使肠道通透性增加。Yang等［10］的研究显示，内毒素血症小鼠的肝脏Kupffer细胞可分泌HMGB1至胆汁中，此种含HMGB1的胆汁可破坏肠黏膜屏障，促进肠道菌群易位。沈美琴等［11］对33例SAP和38例MAP患者的临床研究发现，患者血清HMGB1水平在发病24 h内开始增高，48 h内达峰值后开始下降，至72 h仍维持在高于正常值的水平。因此本研究在患者发病72 h内采集外周血标本，观察患者血清HMGB1含量的变化。

本研究结果显示，MAP组患者血清HMGB1含量显著高于正常对照组，SAP组显著高于MAP组，患者血清 HMGB1含量与 Ranson评分、24 h APACHEⅡ评分以及Balthazar CT评分呈正相关，提示血清HMGB1含量可反映AP病情严重程度，与既往研究结果相符［12］。此外，本研究还发现血清HMGB1含量与血清内毒素含量、DAO含量、尿液L/M比值呈正相关，且HMGB1含量与内毒素含量、DAO含量、L/M比值之间存在线性依存关系，提示HMGB1可作为判断AP患者肠黏膜屏障损伤的参考指标。

因此，有望通过拮抗HMGB1保护AP患者的肠黏膜屏障，减少内毒素等物质的吸收和细菌易位，从而减少MODS的发生，改善AP患者的预后。然而，HMGB1具体通过何种机制影响肠黏膜屏障功能目前尚不清楚，需进一步深入研究。

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