非诺贝特联合替米沙坦对高脂饲养大鼠胰岛素抵抗的影响

赵卫华，王占胜，尹玉，胡健

（中国医科大学附属第一医院心血管内科，沈阳110001）

代谢综合征由一簇相互作用的危险因子组成，而胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是代谢综合征的中心环节［1］。研究表明，替米沙坦可改善肥胖高血压患者及糖尿病患者IR［2］，非诺贝特可以改善糖尿病患者IR［3］。本研究旨在观察非诺贝特和替米沙坦及其联合应用对IR大鼠IR和糖脂代谢的影响，为两种药物的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

本实验采用了 Storlien 等［4，5］的方法，以自配高脂饲料喂养普通Wistar大鼠建立IR模型。健康雄性Wistar大鼠60只（购于中国医科大学实验动物中心），体质量140～200 g。适应性喂养1周后随机分为普通饮食组（NC组）12只和高脂饮食组（HF0）48只。NC组给予普通标准大鼠饲料（由中国医科大学实验动物中心提供），其热量组成为：碳水化合物63.4%，脂肪16.2%，蛋白质20.4%。高脂组给予自行配制的高脂饲料，其热量组成为：碳水化合物20%，脂肪59%，蛋白质21%。大鼠分笼饲养，自由光照，自由摄取食物和水，每周称1次。6周后再将高脂组大鼠随机分为4组：非诺贝特组（F），替米沙坦组（T），非诺贝特与替米沙坦联合组（F+T）和高脂对照组（HF），每组12只，高脂饮食喂养同时分别给予非诺贝特30 mg/（kg·d）、替米沙坦4 mg/（kg·d）、非诺贝特30 mg/（kg·d）联合替米沙坦4 mg/（kg·d）、蒸馏水灌胃4周。NC组继续普通饮食并蒸馏水灌胃4周。微粒化非诺贝特200 mg/粒，法国利博福尼公司产品；替米沙坦80 mg/片，勃林格殷格翰公司产品。

1.2 高胰岛素正常葡萄糖钳夹技术评价IR大鼠模型

药物干预结束时全部大鼠禁食12 h以进行下一步实验。从每组大鼠中随机选取4只做葡萄糖钳夹实验：10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。仰卧位固定大鼠，灯照以保持大鼠体温，行颈部正中切口分离右颈静脉和左颈动脉，分别插入2枚Y型静脉留置针并缝合固定。颈静脉通路用于输注胰岛素和葡萄糖，颈动脉通路用于取血标本检测葡萄糖浓度，颈动脉导管则接一装有肝素生理盐水的注射器进行抗凝。葡萄糖和胰岛素输注速率由微电脑数字显示式注射器泵控制。手术完毕后先静止30 min，再抽取动脉血0.5 mL测定基础血糖和血清胰岛素水平，然后以恒定速度4 mU/（kg·min）输注胰岛素，每5 min采血1次，用自动血糖仪测定葡萄糖浓度，当血糖低于基础血糖时开始输注10%葡萄糖溶液。葡萄糖输注速率从5 mg/（kg·min）开始，根据血糖调整葡萄糖输注速率，使血糖保持在基础血糖水平±0.5 mmol/L范围。当连续3次血糖均在上述范围时即达到了稳定状态。记录后1 h 13次葡萄糖输注速率，取其平均值即为葡萄糖输注率（GIR）。

1.3 大鼠血压测定

每组大鼠再各随机取出4只进行有创性颈动脉血压测定：10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠并仰卧位固定，颈正中切口分离出右侧颈动脉，插入事先充满肝素溶液的静脉留置针，尾端通过三通连接于血压测定仪。稳定10 min后记录血压，持续时间为30 s。

1.4 生化指标测定

自动血糖检测仪测定各组大鼠的鼠尾血糖值（FPG）。麻醉处死大鼠，取下腔静脉血液，立即在4℃恒温下2 500 r/min离心10 min分离血清，分装于1.0 mL EP管中-40℃保存，用于测量血脂、血清空腹胰岛素（FINS）、血清游离脂肪酸（FFA）。采用日立全自动生化仪（7600-110）检测血清脂质，包括甘油三酯（TG），总胆固醇（TC），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。FINS测定采用胰岛素放射免疫分析药盒（北京原子高科股份有限公司），FFA测定采用游离脂肪酸试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.5 大鼠内脏标本的留取

大鼠处死后立即取出大鼠附睾脂肪、肾周围脂肪组织，滤纸吸干后称质量，将标本于液氮中速冻后，置于-80℃冰箱中保存待用。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠体质量和血清学指标变化

HF 组的体质量（BW）、FINS、FPG、FFA、TG、TC、LDL-C 水平显著高于 NC 组（P<0.01），GIR、HDL-C显著低于NC组（P<0.01）。与HF组比较，F组的BW、FINS、TG 显著降低（P<0.01），FFA 降低（P<0.05），GIR、HDL-C显著升高（P<0.01）；T组的 BW、FINS、FPG、TG 显著降低（P<0.01），FFA、LDL-C 降低（P<0.05），GIR、HDL-C 显著升高（P<0.01）；F+T组的 BW 减轻、FINS、FFA、TG 显著降低（P<0.01），FPG、TC、LDL-C 降低（P<0.05），GIR、HDL-C 显著升高（P<0.01）。结果见表1。

2.2 各组大鼠血压和心率变化

表1 5组大鼠体质量和血清学指标比较（±s）T a b.1 C o m p a r i s o n o f B W a n d s e r o l o g i c a l i n d e x e s i n 5 g r o u p s（±s）

表1 5组大鼠体质量和血清学指标比较（±s）T a b.1 C o m p a r i s o n o f B W a n d s e r o l o g i c a l i n d e x e s i n 5 g r o u p s（±s）

C o m p a r e d w i t h g r o u p N C，1）P ＜ 0.0 5，2）P ＜ 0.0 1；c o m p a r e d w i t h g r o u p H F，3）P ＜ 0.0 5，4）P ＜ 0.0 1.

Item n NC HF F T F+T BW（g） 12 421.3±21.67 500±29.982） 432.7±22.644） 435.8±14.624） 431.2±21.654）FINS（mIU/L） 8 8.99±3.88 42.65±20.782） 18.33±10.414） 15.75±11.974） 20.05±14.824）FPG（mmol/L） 8 3.71±0.48 5.17±0.502） 4.94±0.382） 4.21±0.521），4） 4.64±0.282），3）GIR［mg/（kg·min）］422.13±2.029.03±0.852）14.38±1.572），4）18.39±1.802），4）16.80±1.622），4）FFA（μmmol/L） 8 516.17±212.34 1 152.45±415.922） 797.76±243.843） 796.27±372.403） 659.05±300.104）TG（mmol/L） 8 0.77±0.23 1.86±0.062） 1.05±0.194） 1.13±0.221），4） 0.15±0.074）TC（mmol/L） 8 1.01±0.33 1.72±0.532） 1.36±0.28 1.36±0.34 1.28±0.263）LDL-C（mmol/L） 8 0.19±0.08 0.54±0.282） 0.38±0.121） 0.36±0.131），3） 0.37±0.101），3）HDL-C（mmol/L） 8 0.16±0.031 0.06±0.0232） 0.15±0.0244） 0.13±0.0194） 0.16±0.0264）

HF组大鼠的血压水平明显高于NC组（P＜0.01）。T组和F+T组血压与HF组比较明显降低（P＜0.01）；F组血压有所降低，但与HF组比较无统计学差异（P＞0.05）。各组之间平均心率无统计学差异。结果见表2。

2.3 各组大鼠附睾脂肪、肾周围脂肪的质量变化

HF组大鼠的附睾和肾周脂肪质量均明显高于NC组（P＜0.01）。药物干预后3组大鼠的附睾和肾周脂肪质量与HF组比较显著下降（P＜0.01）。结果见表3。

表2 5组大鼠收缩压、舒张压和心率的比较（±s）Tab.2 Comparison of SBP，DBP and HR in 5 groups（±s）

表2 5组大鼠收缩压、舒张压和心率的比较（±s）Tab.2 Comparison of SBP，DBP and HR in 5 groups（±s）

Compared with group NC，1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01；compared with group HF，3）P ＜ 0.05，4）P ＜ 0.01.

Item NC HF F T F+T SBP（mmHg） 77.7±6.99 125.49±21.572） 106.07±8.231） 89.80±13.014） 88.24±16.364）DBP（mmHg） 57.45±2.49 106.60±18.692） 85.62±21.331） 68.19±14.744） 63.12±20.234）HR（beat/min） 328.6±74.43 349.3±29.11 366.1±53.11 339.1±108.72 375.3±44.05

表3 5组大鼠附睾脂肪与肾周围脂肪质量比较（±s）Tab.3 Comparison of the weight of epididymal fat and perirenal fat in 5 groups（±s）

表3 5组大鼠附睾脂肪与肾周围脂肪质量比较（±s）Tab.3 Comparison of the weight of epididymal fat and perirenal fat in 5 groups（±s）

Compared with group NC，1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01；compared with Group HF，3）P ＜ 0.05，4）P ＜ 0.01.

Item NC HF F T F+T Testicular fat（g）9.18±1.5715.25±1.182）11.62±2.022），4）11.44±0.772），4）10.74±1.331），4）Fat around kidney（g） 9.79±1.08 14.45±3.542） 10.54±3.024） 9.80±2.284） 10.14±2.364）

3 讨论

代谢综合征是糖耐量减低、高血压、血脂代谢障碍、高胰岛素血症、IR和肥胖等一系列心血管危险因素集中表现的一种临床综合征，基本的病理特征是IR。高脂肪摄入是引发肥胖的主要因素，给予实验大鼠高脂饮食能够建立起模拟人类代谢综合征的模型。本研究表明，高脂饮食使Wistar大鼠体质量增加的程度明显快于普通饮食喂养的大鼠。在喂养的第4周末，2组间体质量即出现了统计学差异［（277.5±14.18）g vs（292.2±13.77）g，P<0.01］，这种差异持续到实验的全过程。实验结束时采用高胰岛素-正常葡萄糖钳夹技术对模型进行检测发现，HF组大鼠GIR明显降低；通过测定颈动脉血压发现HF组大鼠血压明显增高；血清学指标FPG、FINS、FFA、TG、TC、LDL-C水平明显增高而HDL-C水平下降，提示高脂饮食喂养大鼠已经具备IR代谢综合征的特征，成为稳定可靠的IR动物模型。关于成模时间，不同的实验因选用的动物品系和高脂饲料的不同而有所差异，但一般普通Wistar或SD大鼠在3～6周后即可出现基本的IR特征。本研究显示，高脂饮食喂养的大鼠第10周时出现了明显的IR特征，但此时空腹血糖在HF组明显高于NC组，显然血糖正常而血清胰岛素浓度开始增高出现的时间在10周之前。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是配体激活的核转录因子，在调节糖、脂肪等能量代谢发挥着重要的作用。非诺贝特是PPARα的激动剂，直接通过增加基因转录而增加脂蛋白脂肪酶（LPL）活性，降低血液循环中的TG水平，间接通过降低载脂蛋白C-Ⅲ来增加LPL活性，上调载脂蛋白A-I和A-Ⅱ来增加血循环中的HDL-C水平。非诺贝特除了降脂作用外，还能够改善 IR［6，7］，在不影响热量摄入的情况下，防止高脂饲料喂养引起的IR动物模型体质量增加［8］。本研究观察到，非诺贝特处理后高脂饮食大鼠血清 FINS、TG、FFA 水平降低，GIR、HDL-C显著升高，同时大鼠体质量增长明显减缓，内脏脂肪减少，胰岛素敏感性增加，IR得到改善，与Ferreira等［9］的研究结果相似。

替米沙坦是血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）阻断剂（ARBs），是选择性PPARγ激动剂。基础研究表明，替米沙坦在大鼠中通过减弱炎性反应来对抗IR［10］。本研究中替米沙坦降低了IR大鼠PFG、FINS、FFA、TG 水平，升高 GIR、HDL-C，改善 IR，支持Vitale等［11］的研究结论。替米沙坦在改善IR的同时还能减轻体质量，减少内脏脂肪，这一点与噻唑烷二酮类（TZDs）不同。TZDs是完全的PPARγ激动剂，在改善IR同时能明显增加体质量。其原因可能是激活PPARγ后两者调控的靶基因不同所致。

非诺贝特和替米沙坦联合应用是将PPARα与PPARγ激动剂共同干预大鼠的IR状态。Bhalodia等［12］对大鼠的肾脏缺血再灌注损伤的研究中，非诺贝特和替米沙坦联合应用可协同增强PPAR的激活。本研究观察到联合应用可以明显降低大鼠体质量、FPG、FINS、FFA、TG、TC，显著提高 GIR、HDL-C。PPARα激动剂可加速胆固醇向HDL-C转运，PPARγ激动剂可促进巨噬泡沫细胞中胆固醇的溢出，随即由HDL-C运输至肝脏处理［13］，从而降低循环中的胆固醇浓度。本研究中单独应用非诺贝特和替米沙坦时对TC虽然有所降低，但与HF组比较无统计学差异，联合应用后却明显降低了胆固醇水平，显示出两种药物降低胆固醇的叠加作用。单独应用非诺贝特和替米沙坦均显著提高GIR，联合用药后GIR改善程度较单独应用替米沙坦增高而较单独应用非诺贝特降低，但3组间无统计学差异。非诺贝特可降低血压，替米沙坦亦降低血压，两药联合应用后血压明显降低。总之，本研究表明，联合应用非诺贝特和替米沙坦能够明显减轻机体脂质代谢紊乱，促进游离脂肪酸的吸收和分解，降低血浆甘油三酯及总胆固醇水平，降低血压，并且不增加体质量，能够更好地改善IR，为临床合理联合用药提供了理论依据。

［1］Lefebvre P，Chinetti G，Fruchart JC，et al.Sorting out the roles of PPAR alpha in energy metabolism and vascular homeostasis［J］.J Clinical Inves，2006，116（3）：571-580.

［2］Huang GZ，Tang YH，Wang BY，et al.Effects of telmisartan on insulin resistance and visceral fat distribution in Chinese hypertensive patients with obesity［J］.Saudi Med J，2011，32（10）：1017-1021.

［3］Adeghate E，Adem A，Hasan MY，et al.Medicinal Chemistry and Actions of Dual and Pan PPAR Modulators［J］.Open Medi Chem J，2011，5（Suppl 2）：93-98.

［4］Storlien LH，James DE，Burleigh KM，et al.Fat feeding causes widespread in vivo insulin resistance，decreased energy expenditure，and obesity in rats［J］.American J Physi，1986，251（5 Pt 1）：E576-E583.

［5］程海波，司晓晨，尚文斌，等.高脂饲料和高果糖餐分别诱导胰岛素抵抗大鼠模型的胰岛素敏感性［J］.中国临床康复，2006，10（7）：121-123.

［6］Frick MH，Elo O，Haapa K，et al.Helsinki Heart Study：primary-prevention trial with gemfibrozil in middle-aged men with dyslipidemia.Safety of treatment，changes in risk factors，and incidence of coronary heart disease［J］.New Eng J Med，1987，317（20）：1237-1245.

［7］Nagai Y，Nishio Y，Nakamura T，et al.Amelioration of high fructoseinduced metabolic derangements by activation of PPARalpha［J］.Am J Physi，2002，282（5）：E1180-E1190.

［8］Guerre-Millo M，Gervois P，Raspe E，et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor alpha activators improve insulin sensitivity and reduce adiposity［J］.J Biolo Chem，2000，275（22）：16638-16642.

［9］Ferreira AV，Parreira GG，Green A，et al.Effects of fenofibrate on lipidmetabolisminadipose tissue of rats［J］.Meta Clini Exper，2006，55（6）：731-735.

［10］Xu X，Yin X，Feng W，et al.Telmisartan protects against insulin resistance by attenuating inflammatory response in rats［J］.JHuazhong Uni Scie Techn Med Sci，2011，31（3）：317-323.

［11］Vitale C，Mercuro G，Castiglioni C，et al.Metabolic effect of telmisartan and losartan in hypertensive patients with metabolic syndrome［J］.Cardiovas Diabet，2005，5（4）：6.

［12］Bhalodia Y，Sheth N，Vaghasiya J，et al.Role of fenofibrate alone and in combination with telmisartan on renal ischemia/reperfusion injury［J］.Ren Fail，2010，32（9）：1088-1094.

［13］Berger JP，Akiyama TE，Meinke PT.PPARs：therapeutic targets for metabolic disease［J］.Tren Pharma Sci，2005，26（5）：244-251.