脊柱结核植入内固定安全性的体外实验研究

矢庆明，殷 明，顾玉荣，吴 凯，吴 庆

（南昌大学第二附属医院骨一科，南昌 330006）

脊柱结核又称为Pott’s病，Percival Pott在1877年首次报道由结核菌引起脊柱后凸畸形伴有截瘫的脊柱疾患。近年来，随着HIV感染者数量增加结核发病率明显增高[1]。大多数脊柱结核呈隐匿性起病，从症状出现到临床确诊平均需11.2个月[2]，患者往往在神经压迫症状出现后数周、数月因症状加重甚至出现瘫痪才就医，通过前路病灶清除可以对病灶处的脓液、死骨等坏死组织及结核杆菌作直接最有效的清除，术中为重建脊柱稳定性及矫正术前畸形往往需要植入内固定材料及自体骨，尽管术中通过冲洗等方式对结核杆菌进行了有效地清除，但结核杆菌仍不可避免的在病灶内有残留。以往研究早已证明，引起生物材料相关感染的初始动因就是细菌对生物材料的黏附[3]。生物材料的细菌黏附是指细菌与生物材料表面发生的特异性结合，对机体及材料的黏附几乎是所有细菌所具有的普遍性能[4]。细菌表面的菌毛、肽聚糖、有黏附功能的荚膜、细胞外黏质（Extracellar Slime Substance,ESS）、脂壁酸等称为黏附素（A dhesin）,是黏附过程中的配体，生物材料表面与黏附素结合的位点叫受体，黏附就是受体与配体的特异性结合[4]。细菌对生物材料黏附后形成的包绕材料表面的生物膜可以避免细菌被机体吞噬细胞及抗生素杀灭，而且会不断向组织、血液中释放细菌形成慢性感染源，造成术后感染迁延不愈或复发。所以通过观察结核杆菌对材料的黏附情况能对术中植入内固定材料的安全性评估提供实验依据。笔者通过在体外模拟脊柱结核患者病灶清除植骨内固定术后体内环境，将3种不同材料的内固定分别与结核杆菌及表皮葡萄球菌共同培养，并通过扫描电镜观察，比较不同细菌对不同材料的黏附情况，并探讨脊柱结核病灶清除后植入内固定的安全性问题，为临床选择合理术式及安全的内植物材料提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

不锈钢 316L、钛合金 Ti6AL4V、纯钛 CPTi，（山东威高骨科材料有限公司提供）。将材料切割加工成直径6.0 mm、厚度2.0 mm的圆片，其表面粗糙度和临床产品保持一致。每种材料制备48片，经蒸馏水洗涤，高压蒸汽灭菌后保持无菌备用。

1.2 实验菌株

结核分枝杆菌 （mycobacterium tuberculosis，MTB）标准株H37Rv，江西省胸科医院检验科提供；表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis，SE）标准株NCCPBP26115，南昌大学基础医学院微生物学教研室提供。

1.3 实验菌液的制备

将结核杆菌接种于Middlebrook7H12液体培养基（购自美国Bacton-Dickinsn公司）中37℃恒温培养4周，表皮葡萄球菌接种于常规肉汤培养基中培养1 d，分别离心收集细菌，生理盐水洗涤，再将结核杆菌注入Middlebrook 7H12液体培养基中制成浓度为108 CFU·m L－1悬液备用，将表皮葡萄球菌注入常规肉汤培养基中制成浓度为108 CFU/ml悬液备用。

1.4 细菌培养及黏附

将上述材料各取4片分别置入结核杆菌及表皮葡萄球菌菌液中37℃恒温共同培养。在结核杆菌与材料共同培养的过程中，每5 d各取出材料1片；在表皮葡萄球菌与材料共同培养的过程中，每4 h各取出材料1片。此实验步骤重复进行6次。

1.5 材料表面细菌黏附情况的电镜观测

将取出材料用生理盐水洗涤3遍去除表面的培养液及未黏附的细菌，然后置入2.5%戊二醛中固定4 h，再分别用70%、80%、90%、95%的乙醇逐级脱水，室温下自然干燥，在扫描电镜（S-3000N，HITACHI）下观测各材料表面的细菌黏附情况。在每片材料上随机选取10个视野，计算黏附细菌总数并求出每视野内细菌数均值，以时间为变量绘制细菌黏附曲线图。

1.6 统计学方法

以细菌种类分类、材料性质分类作为分组变量，取黏附曲线图中各材料黏附不同细菌数量最高值为观测指标，对表1所示统计资料行两因素析因设计定量资料方差分析，采用SPSS17.0软件进行统计计算。

2 结果

2.1 以时间为变量的细菌黏附曲线图

根据图1、2发现，结核杆菌黏附数量开始随时间推移逐步增多，到培养第10 d到达高峰并基本维持稳定，黏附数量有少许波动；表皮葡萄球菌在培养4 h第1次取出材料检测时黏附数量即在高峰值，而后3次黏附数量稍有下降。

图1 结核杆菌对不同材料的黏附动态曲线

图2 表皮葡萄球菌对不同材料的黏附动态曲线

2.2 结核杆菌和表皮葡萄球菌对同种材料黏附的对比

根据表1可以发现在不锈钢、钛及钛合金材料上，表皮葡萄球菌的黏附数量都明显高于结核杆菌的黏附数量，随后的表2方差分析结果提示2种细菌对同种材料的黏附差异具有统计学意义。

2.3 不同材料上的结核杆菌黏附比较

根据表1可以发现在不锈钢材料上结核杆菌的黏附数量要高于钛及钛合金材料上的结核杆菌的黏附数量，随后的表2方差分析结果也提示结核杆菌对不锈钢材料的黏附量与其对其他2种材料的黏附量之间的差异有统计学意义。

表1 2种细菌在不同材料表面黏附最高数量均值±s，n=6，个·视野－1

表1 2种细菌在不同材料表面黏附最高数量均值±s，n=6，个·视野－1

材料 结核杆菌 表皮葡萄球菌不锈钢 9.78±0.884 132.56±6.40纯钛 6.52±1.22 78.65±10.84钛合金 5.81±0.91 89.51±11.33

表2 统计分析结果

3 讨论

在前言中已经提到，细菌对生物材料的黏附是引起生物材料相关感染的初始动因，既往研究表明，细菌对材料的黏附是一个动态变化的过程，而且与细菌的生长关系密切[5]。所以本次实验中将结核杆菌和内固定材料一起培养动态观察细菌的黏附情况。笔者选择生物材料相关感染中常见的致病菌表皮葡萄球菌作为本次实验的对照细菌，实验中将培养和取材观察步骤重复进行6次以减少随机误差。不同细菌在培养液中的生长传代周期不同，表皮葡萄球菌和临床常见细菌一样，生长速度快，一般20min就可繁殖一代；而结核杆菌对营养需求高，生长较慢，一般需14~18 h繁殖一代[6]。在实验中根据细菌生长的速度分不同时段4次取出材料观察表面的细菌黏附情况，绘制出动态黏附曲线图，结果证实两种细菌对材料的黏附均是一个动态变化的过程，因本次实验未进行细菌的传代测定，所以均取4个时段中黏附数量最高1次的数据进行统计分析，可以较为准确地反映细菌对材料的最大黏附能力，结果发现在3种材料上表皮葡萄球菌的黏附数量均明显高于结核杆菌，也就是说明结核杆菌对生物材料的黏附能力明显弱于临床常见致病菌表皮葡萄球菌，不易导致以内固定材料为中心的结核慢性感染或感染复发。探讨其原因仍考虑结核杆菌作为特异性感染的菌源，一方面可能因其对生长环境营养要求高、生长速度缓慢、生物学活性相对较弱；另一方面和该细菌缺乏菌毛、鞭毛、荚膜以及分泌的ESS等黏附素，难以形成细菌表面的黏附配体和包绕内固定材料表面的生物膜有重要相关。

近年来随着医用材料学的发展，骨科内固定材料的研制更新也是日新月异。本次实验采用了临床最常用的内固定材料不锈钢、钛及钛合金，而且材料表面粗糙度和临床使用产品保持一致，所以实验结果对临床内固定材料的选择更具指导意义。材料表面的化学组成、临界表面张力、界面能、表面亲水、疏水性、表面电荷等对细菌的黏附均有较大影响，所以不同材料即使对同种细菌的黏附力也是有差别的[4]。在本次实验中也发现结核杆菌对3种不同材料的黏附数量存在差别，在本次实验结果经统计分析表明在体外结核杆菌对不锈钢材料的黏附力明显强于钛和钛合金材料，而对后两种材料的黏附力没有显著的差别。通过本次实验研究，认为脊柱结核患者行病灶清除植骨内固定的术式是合理安全的，不易诱发术后结核感染迁延不愈或复发，在内固定材料的选择上，笔者推荐使用钛或者钛合金材料。

[1]Bho jraj S，Nene A.Lumbar and lumbosacral tuberculous spondylodiscitis in adults[J].JBone.Jt Surg Br，2002，84（4）：530-534.

[2]Ramani P S，Sharma A，Jituri S，et a1.Anterior instrumentation for cervical spine tuberculosis：an analysis of surgicalexperiencewith 61 cases[J].Neurol India，2005，53（1）：83-89.

[3]Naylor P T,Myrvik Q N,Gristina A.Antibiotic resistance ofbiomaterial-adherentcoagulase-negativeand coagulasepositive staphylococci [J].Clin Orthop Related Research，1990，（261）：126-133.

[4]黄云超，张尔永，石应康.生物材料细菌粘附的研究进展[J].国外医学：生物医学工程分册，1999，22（3）：148-153.

[5]黄云超，张尔永，石应康，等.人工心脏瓣膜材料细菌粘附的体外实验[J].生物医学工程学杂志，1999，16（4）：406-410.

[6]王鹏翔，赵剑，赵敦炎，等.结核杆菌在不同内固定材料表面粘附情况的实验研究[J].交通医学，2007，21（1）：11-13.