番茄抗叶霉病基因Cf-10和Cf-16的遗传分析及SSR标记

李 宁，许向阳，姜景彬，李景富

（1.湖北省农业科学院经济作物研究所，武汉 430064；2.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

番茄叶霉病（Fulvia fulva（Cook）ciferri）是番茄保护地生产中的主要病害，它即影响番茄的产量又影响果实的品质，造成经济损失[1]。目前，选育和推广抗病品种是解决番茄叶霉病最为经济、有效和环保的途径。但是防治番茄叶霉病是十分困难的，这主要是因为番茄叶霉病原菌生理小种分化十分迅速，育成含有新的Cf抗病基因的栽培品种后不久，就会分化出侵染该基因的新生理小种[2-5]。例如，目前国内抗叶霉病育种中普遍应用的抗源Cf-4基因已被侵染，侵染抗源Cf-9基因的生理小种在华北地区也被监测出来[6]。因而利用最新的、较高抗性的Cf基因将是我国叶霉病抗病育种的重要目标之一。已报道有多个抗叶霉病基因在番茄栽培种及野生种中被发现，它们能够克服不同的叶霉病生理小种[2,7-9]，鉴定和应用新的抗源成为番茄抗叶霉病育种及研究中的新工作。

番茄与叶霉病病原菌的互作遵循“基因对基因”学说[10]，开展番茄抗叶霉病育种工作要根据当地叶霉病病原菌生理小种的分化情况，将抗病基因对不同生理小种的抗病性进行鉴定，以便合理应用抗源。传统的人工接种抗病性鉴定，不仅需要较长的时间和花费较多的人力物力，直接影响多抗性新材料及新品种的选育进程，而且还易受环境条件、接种技术等影响，从而导致鉴定结果不稳定。抗病育种是一个长期策略，合理利用抗病种质资源保持持久抗性十分重要。分子标记技术为快速筛选抗病基因鉴定提供了一项有力手段。利用分子标记技术对叶霉病抗病基因的研究已取得较大进展，Cf-4和Cf-9基因紧密连锁位于染色体1短臂的Milky Way位点[11-12]；Cf-2和Cf-5基因紧密连锁位于染色体6短臂[13-14]，Cf-6基因同样位于染色体 6 短臂[15]；Cf-11[16-17]、Cf-12[18-19]和Cf-19[16,20]也分别被定位于染色体上。

Cf-10和Cf-16基因是北京市农林科学院蔬菜研究中心从国外引进的番茄叶霉病抗源材料，目前针对这两个抗源的研究较少。为了更有效地利用Cf-10和Cf-16基因进行番茄抗叶霉病育种及其他理论研究，本研究利用我国东北三省分化的叶霉病病菌生理小种分别对Cf-10和Cf-16基因进行抗性鉴定、遗传分析和分子标记，以明确Cf-10和Cf-16基因的抗性并进行分子定位，从而为下一步开展Cf-10和Cf-16基因的分子标记辅助育种和基因克隆奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

番茄抗叶霉病亲本材料08HN30（含Cf-10基因）、08HN34（含Cf-16基因）由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供；感病亲本材料07880、07881及不含任何抗性基因（Cf-0基因）的感病对照材料Money Maker由东北农业大学番茄研究所提供。分别构建07881×08HN30和07880×08HN34的F2代分离群体。

1.2 对不同生理小种的抗病性鉴定及抗性遗传分析

东北三省叶霉病生理小种，由东北农业大学番茄研究所收集、分离和鉴定[21]，共8个生理小种：1.2、1.2.3、1.2.3.4、1.2.4、1.3.4、2.3、1.3和 1.4，用于08HN30和08HN34的生理小种抗病性鉴定。同时选用东北三省优势生理小种1.2.3.4接种07881×08HN30和07880×08HN34组合的父母本、F1、F2代，进行抗性遗传分析。

采用喷雾接种法进行接种，接种苗龄为4片真叶期，浓度为107孢子·mL-1。接种前保持湿度100%，温度22～25℃，3 d使叶霉菌进行繁殖，相对湿度降至80%保持11 d，接种14 d后调查发病情况。

1.3 病情分级标准

单株分级标准：0级—无症状；1级—接种叶有直径1 mm的白斑或坏死斑；3级—接种叶有直径2～3 mm的黄化斑，叶背面有少量白色霉状物；5级—接种叶有直径5～8 mm的黄化斑，叶背面有许多白色霉状物；7级—接种叶有直径5～8 mm的黄化斑，叶背面有黑色霉状物，同时上部叶片也有黑色霉状物；9级—接种叶病斑上有大量孢子，上部叶片也有孢子形成[16-18]。其中发病级别为0级、1级、3级为抗病株，5级、7级、9级为感病株。群体分级标准：免疫—病情指数为0，无侵染；高抗—0＜病情指数≤11；抗病—11＜病情指数≤22；中抗—22＜病情指数≤33；感病—33＜病情指数≤55；高感—病情指数＞55[16-18]。

1.4 DNA的提取及抗感池的建立

基因组DNA的提取采用CTAB法[22]，1.0%琼脂糖凝胶检测DNA完整性，生物光度计测定DNA浓度，调整各样品DNA浓度均为50 ng·μL-1。参照Michelmore等建立的混合分组分析（Bulked segregant analysis，BAS）法[23]，从F2代作图群体中随机选取10株抗病植株和感病植株，各取等量的DNA混合，对在双亲间表现多态性的引物进行进一步的筛选。

1.5 SSR分析

共选用341对SSR引物序列用于筛选抗病基因的连锁标记，分别来自SOL Genomics Network（http://www.sgn.cornell.edu/index.pl）及文献[24-25]。PCR反应体系为20 μL，其中包括1 μL DNA，2.0 mmol·L-1dNTP 和20 mmol·L-1MgCl2各2.0 μL，各1.5 μL SSR上下游引物，10 UTaqDNA聚合酶0.2 μL，10×PCR buffer 2 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35～62℃（依据引物而定）退火1 min，72℃延伸2 min，共38个循环；最后72℃延伸10 min。SSR扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测，银染显色[26]，观察检测结果。

1.6 数据分析及遗传距离的计算

χ2测验检测F2代抗感分离比率。Mapmaker 3.0[27]软件计算标记与Cf-10、Cf-16基因的连锁关系，Kosambi函数转换为遗传距离（cM）[28]，LOD的临界值设为3.0。应用Mapchart 2.1绘制遗传图谱。

2 结果与分析

2.1 抗性鉴定及遗传分析

接种2006～2007年东北三省监测分化的8个叶霉病病原菌生理小种，以感病材料Money Maker为对照，分别对番茄叶霉病抗性基因Cf-10和Cf-16进行抗病性鉴定。结果表明：08HN30对东北三省分化出的8个叶霉病病原菌生理小种均表现为抗病或免疫；08HN34对除生理小种2.3外的叶霉病病原菌生理小种均表现抗病。

选用生理小种1.2.3.4分别对07881×08HN30和07880×08HN34的父母本、F1和F2代进行苗期接种鉴定，结果显示：两个杂交群体的F1代均表现为抗病；F2代发生抗感分离。统计F2代群体抗感分离比例后，经χ2测验，均符合3∶1的分离比率（07881×08HN30：χ2=0.0156，χ23∶1=3.84；07880×08HN34：χ2=0.1437，χ23∶1=3.84），表明两份抗原材料08HN30和08HN34对生理小种1.2.3.4的抗性均由单个显性基因控制。

表1 Cf-10和Cf-16抗病基因的抗性鉴定Table 1 Resistance identification of Cf-10 and Cf-16 gene by inoculation with C.fulvum

2.2 抗叶霉病基因Cf-10和Cf-16的SSR标记

341对引物用于分析亲本间的多态性，07881×08HN30组合初步筛选出56对引物在两亲本间表现出多态性差异，占全部引物的16%。

经多次重复结果稳定，利用初筛获得的56对引物进一步在抗感池中进行复筛，筛选出18对差异明显且稳定的引物用于F2代单株的筛选。用Mapmaker/Exp 3.0软件计算表明，引物LEtaa001（Forward primer:TGTAAGAGTGTCTGCCTGCAC；Reverse primer:ATGGGTTCGGGTTAGCTCTT）和LEaat003（Forward primer:TGTAAGAGTGTCTGCCTGCAC；Reverse primer:ATGGGTTCGGGTTAGCTCTT）与Cf-10基因连锁，遗传距离分别为9.7和22.9 cM；带型统计表明，LEtaa001和LEaat003标记在08HN30与07881杂交获得的F2代群体中均表现为1∶2∶1的分离比率（见图1、2）。

图1 引物LEtaa001在07881×08HN30的F2分离群体中的部分扩增结果Fig.1 PCR amplification results using primer LEtaa001 in partial individuals of F2population in cross 07881×08HN30

图2 引物LEaat003在07881×08HN30的F2分离群体中的部分扩增结果Fig.2 PCR amplification results using primer LEaat003 in partial individuals of F2population in cross 07881×08HN30

07880×08HN34组合初步筛选出67对引物在两亲本间表现出多态性差异，占全部引物的20%，经多次重复结果稳定；进一步在抗感池中进行复筛，筛出27对差异明显且稳定的引物用于F2代单株的筛选。用Mapmaker/Exp 3.0软件计算表明，引物Tom144-145（Forward primer:CTGTTTACTTCAAGA AGGCTG；Reverse primer:ACTTTAACTTTATTATT GCGACG）与Cf-16基因连锁，遗传距离为10.4 cM。根据Suliman-Pollatschek等发表的SSR引物[24]，Tom144-145位于番茄染色体11，由此推断08HN34所含的番茄叶霉病抗性基因Cf-16位于染色体11（见图3）。

图3 引物Tom144-145在07880×08HN34的F2分离群体中的部分扩增结果Fig.3 PCR amplification results using primer Tom144-145 in partial individuals of F2population in cross 07880×08HN34

3 讨论与结论

从20世纪30年代加拿大和美国就开始番茄叶霉病抗病育种研究，并从栽培番茄及野生番茄中筛选出多个抗源应用于番茄抗病育种。国内在20世纪80年代开始应用抗源基因进行抗叶霉病育种，当前国内育成的抗叶霉病番茄品种应用的是Cf-4和Cf-9基因，但从国内各地区关于番茄叶霉病病原菌生理小种分化的监测结果看，能够侵染Cf-4基因的生理小种1.2.3.4是我国大部分地区的优势生理小种，Cf-4基因已经丧失抗性；目前已经开始发现侵染Cf-9基因的菌株1.2.3.4.9[6]。抗病育种是一个长期工作，因而提前对较高抗性、且尚未应用的叶霉病抗病基因Cf-10和Cf-16进行研究，明确抗性基因对叶霉菌生理小种的抗性范围，建立分子标记辅助选择体系，在时间上获得主动权，为应对新分化的致病性更强的番茄叶霉病生理小种做好准备是十分重要的工作。

本试验中，08HN30和08HN34均对东北三省分化出的生理小种表现出较强的抗性，对优势生理小种1.2.3.4的抗性表现为受核显性单基因控制，可以应用于当前的抗病育种工作中且非常容易通过杂交的方法导入抗病基因。建立了与Cf-10连锁的SSR标记LEtaa001和LEaat003，遗传距离分别为9.7和22.9 cM；与Cf-16连锁的SSR标记Tom144-145，将Cf-16基因定位于染色体11，这与Kanwar等通过经典遗传定位的结果相同[29]。对Cf-10和Cf-16基因的抗性鉴定和初步定位为进一步合理利用叶霉病抗性基因奠定了理论基础和实践依据，下一步的研究将根据染色体定位的结果，结合已发表的番茄遗传图谱和相关染色体测序信息，开发新的SSR对抗性基因进行精细定位，为图位克隆相关基因奠定基础。

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