铬污染对李氏禾生理指标的影响

黄 斌，张 达，李 洋，张 霞，郝再彬,

（1.桂林理工大学化学与生物工程学院，广西 桂林 541004；2.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

近年来,由于工业的迅猛发展，工业“三废”的排放，使得大面积的土壤受到了重金属的污染[1]。土壤中的重金属可经水、大气及生物链最终危害人体健康，且此类污染具有长期性、隐蔽性和不可逆性的特点，可见各种重金属对环境的污染及破坏已严重危害到人们的身心健康、制约了经济的发展，因此寻求治理此类污染的办法迫在眉睫。近些年来，利用植物修复环境已成为污染治理研究领域的一个前沿性课题并引起了人们的广泛重视[2]。植物修复（Phytoremediation）是利用绿色植物来转移、容纳或转化污染物使其对环境无害[3]。植物修复的对象是重金属、有机物或放射性元素污染的土壤及水体[4-5]。研究表明，通过植物的吸收、挥发、根滤、降解、稳定等作用，可以净化土壤或水体中的污染物，达到净化环境的目的，因而植物修复是一种很有潜力、正在发展的清除环境污染的绿色技术。该技术具有成本低、不破坏土壤和河流生态环境、不引起二次污染等优点[6]。

广西北部某电镀厂排污口发现的一种植物—李氏禾，其对铬具高富集能力已被张学洪等证实[7]，这为铬污染土壤的人工湿地修复技术提供了一种新的植物种类。目前，大量的研究表明，铬胁迫对植物的生理和结构都会造成严重影响[8-9]，而李氏禾对铬的耐性机理却少有报道。本文以不同来源李氏禾为材料，通过对比不同来源李氏禾在正常以及铬污染环境中生理生化指标的差异，分析了在一定铬浓度胁迫下，李氏禾各项生理生化指标的变化，探讨其对重金属污染的耐受性，为筛选适于水体或土壤污染的植物修复材料提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对照组材料

本试验选用三种李氏禾材料：采自桂林市桃花江边的李氏禾（材料1）；采自桂林某电镀厂废水排污口生长的李氏禾，对铬有极强的耐性（材料2）；利用植物组织培养法对材料2进行了扩繁的后代（材料3）。2008年4月选取长势良好的三种材料移栽于无污染的栽培池中，为对照组，每种材料各100株，次年取材测定。

1.1.2 处理组材料

将另一栽培池的四周及底部铺上一层塑料薄膜，模拟电镀厂废水排污环境，配制K2Cr2O7溶液（20 mg·L-1），与栽培土壤均匀混合后放入池中。2008年8月上旬将上述三种材料各50株移栽至池中作为处理组，使其终年生长于其中。每组对应的材料分别为材料4、材料5和材料6，定期浇灌配置好的K2Cr2O7溶液，使栽培土中Cr6+尽量保持一定浓度不变。次年取材测定。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理及各种生理指标测定

2009年10月上旬，分别取上述六种材料（各取15株）的叶片，摘取时间上午8∶00～9∶00，去离子水冲洗3次，然后105℃下杀青30 min，80℃烘干4 h，分装后于4℃冰箱保存，用于以下测定：丙酮法测定叶绿素含量[10]，DNS（3，5-二硝基水杨酸法）比色法测定还原糖含量[10]，巴比妥酸（Barbituric acid，TBA）显色法测定丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量[10]，三氯化铝显色法测定类黄酮含量[11]。

2009年10月上旬，分别取上述六种材料（各取15株）的叶片，摘取时间上午8∶00～9∶00，去离子水冲洗3次后，加入适量预冷的磷酸缓冲液（pH 7.8，含有1%聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂于冰浴上匀浆，在4℃下离心20 min，取上清液用于以下测定：茚三酮显色法测定脯氨酸含量[10]，考马斯亮蓝G250法测定可溶性蛋白含量[10]，氮蓝四唑（Nitrogen blue tetrazolium，NBT）显色法测超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性[10]，愈创木酚法测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性[10]，紫外吸收法测定过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性[10]。

1.2.2 SDS-PAGE电泳

2009年10月上旬，分别取上述六种材料的叶片，各取0.5 g，摘取时间上午8：00～9：00，用去离子水冲洗3次后，加入3 mL预冷的蛋白提取液（pH 8.0，含有1%聚乙烯吡咯烷酮和Tris-HCl缓冲液）及少量石英砂于冰浴上匀浆，静置2 h后，于4℃下离心20 min，取上清液2 mL用于SDS-PAGE电泳。分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。上样量均为25 μL，在室温下进行电泳。上述试验均为3次重复。

1.3 数据处理与分析

试验结果用Excel软件进行数据处理与分析。结果用平均值±标准差表示，材料之间用t-检验法进行比较，P＜0.05被认为有显著差异；反之为不显著。成对比较组别有相同环境下，材料2与1的比较；材料2与3的比较；材料5与4的比较，材料5与6的比较；不同环境中，材料1与4的比较，材料2与5的比较，材料3与6的比较。

2 结果与分析

2.1 铬污染对李氏禾叶片叶绿素及类胡萝卜素含量的影响

重金属毒害植物的一个重要特征就是引起叶绿素减少、蛋白质含量降低，从而使植物失绿，产生毒害现象[12]。处理组材料的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素和类胡萝卜素含量均显著低于（P＜0.05）对照组的相应材料，说明土壤中过多的Cr6+已经在李氏禾体内产生一定的毒害作用，Cr6+可能与叶绿体中蛋白质上的巯基结合或取代其中的Fe2+、Zn2+和Mg2+，破坏了叶绿体的结构和功能[13]，从而使植物叶片内叶绿素含量有所降低（见表1）。

其次，无论是对照组还是处理组，叶绿素总量是材料1、2、3或4、5、6呈逐渐升高的趋势；同时材料3的含量高于材料2、材料6高于材料5，差异显著（P＜0.05）。这很可能是因为材料2在放入无污染的栽培土之前，长期生长在铬污染的环境中，从而产生了某些耐性机制从而减少了Cr对叶绿素的伤害；在处理组中生长的材料6继承了材料3的这一特性。由此可见，叶绿素含量有稳定遗传的倾向。

2.2 铬污染对李氏禾叶片还原糖、丙二醛和类黄酮含量的影响

表1 铬胁迫下李氏禾叶片叶绿素及类胡萝卜素含量的变化Table 1 Change of chlorophyll and carotenoid content in leaves of Leersia hexandra under Cr stress

表2 铬胁迫下李氏禾叶片还原糖、丙二醛和类黄酮的含量的变化Table 2 Change of reducing sugars,MDA,and flavonoid content in leaves of Leersia hexandra under Cr stress(mg·g-1)

由表2可知，在处理组中生长的3个材料，其还原糖、MDA及类黄酮的含量均高于对照组的3个材料，差异较显著（P＜0.05）。

植物叶内可溶性糖含量代表碳水化合物的运转情况，亦可以作为生理指标之一来反映重金属污染对作物的毒害作用[14]。处理组3个材料叶片的还原糖含量均高于对照组，差异较显著（P＜0.05）（见表2）。说明一定浓度的铬胁迫下可促进李氏禾叶片内可溶性糖的合成。植物在逆境中，细胞原生质膜中的不饱和脂肪酸会发生过氧化作用产生MDA，因而MDA含量可反映膜脂过氧化作用的强弱[15]。处理组3个材料叶片的MDA积累均显著高于对照组（P＜0.05）（见表2），可能是处于一定铬浓度胁迫下，体内产生并积累大量活性氧引发了膜脂过氧化。

处理组3个材料叶片的类黄酮化合物均显著高于对照组（P＜0.05）（见表2）。类黄酮化合物是植物体内重要的次生代谢物，一些体外实验也证明，类黄酮物质具有很高的抗氧化活性，具体表现为减少自由基的产生和清除自由基两个方面，其在植物适应逆境过程中发挥重要的作用[16]。

2.3 铬污染对李氏禾叶片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响

脯氨酸是一种较理想的渗透调节物质，其在抗逆中的作用是作为渗透调节物质[17]，来保持原生质与环境的渗透平衡，防止水分散失，逆境下可用作反映植物抗逆性的参考性生理指标[18]。在抗逆中脯氨酸还有保持膜结构的完整性的作用[19]，如果植物体内蛋白质的合成受阻，会抑制脯氨酸掺入蛋白质而造成脯氨酸的大量积累[20]。处理组的3个材料，其叶片的脯氨酸含量均显著低于对照组（P＜0.05）；而可溶性蛋白含量均显著高于对照组（P＜0.05）（见表3），说明在一定铬浓度的胁迫下3个材料体内蛋白质的合成受到一定程度的刺激。

表3 铬胁迫下李氏禾叶片脯氨酸和可溶性蛋白含量的变化Table 3 Change of proline and soluble protein content in leaves of Leersia hexandra under Cr stress

2.4 铬污染对李氏禾叶片SOD、POD和CAT活性的影响

由表4可知，处理组3个材料的SOD和POD酶活性显著低于对照组（P＜0.05）；而CAT酶活性则显著高于对照组（P＜0.05）。说明一定铬浓度的胁迫下，李氏禾体内多种功能膜及酶系统均受到一定程度的破坏，造成SOD及POD活性有所下降；但其体内的CAT活性受到一定的刺激作用而有所的增加，可清除细胞内过量的H2O2，使植物能适应铬的污染。

图1 铬胁迫下李氏禾叶片的SDS-PAGE电泳Fig.1 SDS-PAGE in leaves of Leersia hexandra under Cr stress

由图1可知，3个材料在对照组和处理组中无表达差异的蛋白条带出现，且分子质量为64.6、52.5、47.7和30.2 ku的多肽在图谱中的表达量较明显。说明一定浓度的铬胁迫对李氏禾的蛋白组分没有明显影响；但处理组的蛋白条带亮度明显比对照组强，与表3中的可溶性蛋白含量的增加相一致。

3 讨论

叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，它受重金属的影响也比较明显[9]，且叶绿素减少、蛋白质含量降低是植物受到重金属毒害一个重要特征。本试验发现，与正常环境相比，在一定浓度的铬胁迫下，李氏禾体内叶绿素含量的减少，这是由于其叶绿体的结构和功能均受到一定程度的破坏，从而使植物体内叶绿素含量有所降低。但通过比较两种环境下可溶性蛋白含量的差异，发现在一定铬浓度胁迫下李氏禾体内蛋白质含量有所增加，可能水溶性蛋白质与铬以某种形式结合进而降低了铬对细胞的伤害；而脯氨酸含量则有所降低，可能由于部分脯氨酸参与了水溶性蛋白质的合成，说明李氏禾为适应在铬污染环境下生长而进行了一些生理调节。

在铬污染环境中生长的三种材料，其还原糖、MDA及类黄酮的含量均高于在对照组正常环境生长的三种材料，其原因为李氏禾体内铬过多的积累，不仅破坏了其体内活性氧产生和清除的平衡，造成MDA的大量积累，而且过多的自由基，刺激其体内产生了大量的类黄酮化合物，以达到抑制产生自由基过多的目的。

植物体内活性氧自由基的危害集中体现于其对膜脂的过氧化作用，造成膜脱脂并引起膜渗漏。众多研究证明POD、SOD和CAT是植物体内酶促防御系统的3个重要保护酶，彼此协同起来可以解除细胞内有害的自由基[21]，保护植物细胞免受活性氧的损伤。SOD是超氧自由基清除剂，在逆境胁迫下，当植株体内超氧自由基的增加超过正常歧化能力的极限时，会对组织细胞多种功能膜及酶系统造成破坏，使SOD活性急剧或缓慢下降[12]；POD在清除植物体内产生的有毒物质中有重要意义[22-23]，可用来鉴别环境污染对植物的毒害[24]；CAT能够清除细胞内过多的H2O2，使细胞内H2O2维持在一个正常水平，保护细胞膜结构[25]。在一定铬浓度污染环境中，三种材料的SOD和POD活性有所下降，CAT有所增强，说明其体内多种功能膜及酶系统均受到一定程度的破坏，但是CAT活性的增强可一定程度上阻止破坏的继续，并协同SOD和POD解除细胞内有害的自由基，在一定程度上使李氏禾适应铬污染的环境。

SDS-PAGE分析显示，两种环境下三种材料均无差异蛋白条带出现，说明一定铬浓度胁迫下，李氏禾体内的蛋白组分未受到影响而发生改变。

4 结论

李氏禾在一定铬浓度胁迫的环境中其叶片的叶绿素、可溶性糖、MDA、类黄酮化合物、脯氨酸、可溶性蛋白含量和保护酶SOD、POD、CAT活性能适应铬胁迫并作出相应的调节，从而维持植株良好生长。铬耐性的组培后代李氏禾（材料3、6）在两种环境中的各项生理指标较铬耐性材料（材料2、5）均有较显著的提高。李氏禾可以作为一种具潜力的环境修复植物。

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