辣椒根腐病拮抗细菌D221发酵条件的研究

刘培福，何付丽,，曲春鹤，纪明山，赵长山

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110161）

由腐皮镰孢菌（Fusarium solani）侵染引起的辣椒根腐病，是一种典型的土传病害。该病主要危害根部，病部皮层下呈淡或深褐色[1-2]，一般年份发病率10%，重时达20%～30%，重病地块甚至达50%[3]。目前，国内外系统研究辣椒根腐病的较少，现有的土壤消毒剂中，防效有限，熏蒸剂高毒且价昂，操作麻烦；采取换地移棚的防治方法，不仅使投资增加且局限性强，限制了棚菜生产的发展[4-5]。利用拮抗细菌及其发酵产物防治辣椒根腐病是一种具应用前景的探索[6]。为了实现拮抗细菌的工业化生产，必须优化细菌的发酵条件，目前关于拮抗细菌的发酵培养主要包括液态发酵和固态发酵[7-8]。D221菌株是从辣椒根际土壤中分离得到的，经过离体和活体实验测定，该菌株对辣椒根腐病病原菌有良好的拮抗活性。本试验研究了D221菌株的摇瓶发酵培养基成分、发酵条件对该菌生长和产生抗菌物质能力的影响，为其发酵生产提供依据，并为进一步利用该菌株产生的抗菌物质开发创新农药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

拮抗细菌D221，从生长健康的辣椒植株根际土壤中分离、筛选获得。病原指示菌，辣椒根腐病菌（Fusarium solani），由东北农业大学植物病理实验室提供。

1.1.2 供试培养基

种子培养基，牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1 000 mL；原始发酵培养基，牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 培养基组分的筛选

分别用10 g·L-1葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘油、玉米淀粉代替原始培养基中的碳源，以不加碳源的处理为对照；分别用10 g·L-1蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母膏、尿素、（NH4）2SO4、NH4NO3、NH4Cl和KNO3代替原始培养基中的氮源，以不加氮源的处理为对照；分别用5 g·L-1MgSO4、CH3COONa、K2HPO4、CaCO3、CuSO4、ZnSO4代替原始培养基中的NaCl，以不加无机盐的处理为对照。进行单因子试验，各处理3次重复，通过不同碳源、氮源、无机盐对菌株生长量和产抗菌物质的影响，选择最佳的碳源、氮源和无机盐。

1.2.2 培养基组分的优化

根据1.2.1的筛选结果，碳源选择蔗糖，氮源选择牛肉膏和胰蛋白胨，无机盐选择NaCl和MgSO4，按正交设计表L16（45）安排试验，根据各处理产抗菌物质的能力优化培养基组分。

1.2.3 培养条件的优化

以1.2.2优化出的培养基为基础培养基，温度30℃，接种量10%，转速150 r·min-1，培养48 h为初始条件。将温度分别设为15、20、25、30、35、40℃；初始pH分别设为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；接种量分别设为1%、3%、5%、7%、10%、13%；通气量设定为250 mL摇瓶装液量10、30、50、80、100、120、150 mL；摇床转速分别设为50、100、150、200 r·min-1；培养时间分别设为 16、24、32、40、48、56、64、72 h。进行单因子试验，各处理3次重复。根据D221菌株在不同发酵条件下的产量和无菌滤液的抑菌活性选择最佳发酵条件。

1.2.4 菌体生长量的测定方法

利用SP-1900UVPC型分光光度计测定不同浓度D221菌悬液在625 nm处的吸收值，建立标准曲线，根据菌悬液吸收值计算其含菌量（标准曲线为y=1.3484x+6.9559，R2=0.806）。

1.2.5 无菌发酵液抑菌活性的测定

利用孔碟法测定拮抗细菌D221无菌发酵滤液抑菌活性[9]。将D221菌株发酵液在10 000 r·min-1下离心20 min，取上清液在0.22 μm微孔滤膜过滤器中过滤得到无菌滤液，制备含辣椒根腐病病原菌孢子的PDA平板，用打孔器在平板上等距打两个孔，每个孔内加无菌滤液80 μm，重复3次，30℃培养2 d，测抑菌圈大小[10]。

2 结果与分析

2.1 培养基各成分的优化

由表1可以看出，所试碳源对D221菌株的生长量和产抗菌物质能力都有促进作用。抑菌圈直径从大到小依次为蔗糖＞葡萄糖＞甘油＞麦芽糖＞可溶性淀粉＞乳糖＞糊精＞玉米粉。蔗糖的抑菌圈直径为18.5 mm，并且菌株产量也达到了1.95×108cfu·mL-1，效果明显优于其他碳源，因此选择蔗糖为D221菌株的最佳碳源。

表1 不同碳源对菌株生长量和产拮抗物质的影响Table 1 Effect of different carbohydrate sources on growth and antimicrobial activity of strain D221

由表2可知，D221菌株不能利用供试的无机氮源；有机氮源中，蛋白胨的产量最高，但其抑菌圈直径较小。而胰蛋白胨和牛肉膏的抑菌圈直径明显大于其他氮源，且菌株产量也较高，因此选择胰蛋白胨和牛肉膏为最佳氮源。

表2 不同氮源对菌株生长量和产拮抗物质的影响Table 2 Effect of different nitrogen sources on growth and antimicrobial activity of strain D221

由表3可知，D221菌株在以NaCl和MgSO4为无机盐的培养基中产抗菌物质的能力较强，且产量也较高。因此，无机盐选择NaCl和MgSO4。

表3 不同无机盐对菌株生长量和产拮抗物质的影响Table 3 Effect of different inorganic salt sources on growth and antimicrobial activity of strain D221

2.2 培养基成分含量的优化

根据表4显示，5种培养基成分对D221菌株产抗菌物质能力的影响大小依次为：蔗糖＞牛肉膏＞胰蛋白胨＞NaCl＞MgSO4。各因素的最佳水平为A3B2C4D3E1。因此，D221菌株产抗菌物质的最佳培养基组成为蔗糖2.0%，胰蛋白胨0.5%，牛肉膏2.0%，NaCl 0.5%，MgSO40.1%。

2.3 培养条件的优化

由图1可以看出，D221菌株生长最适温度在30℃左右，而且菌体生长温度与产抗菌物质的要求基本一致，即30℃时，菌株最大生长量为3.4×108cfu·mL-1，抑菌圈直径最大达24.8 mm。随温度升高，菌株产量明显下降，说明温度偏高不利于菌株生长。选用30℃为D221菌株最佳发酵温度。

发酵液的初始pH对该菌株产量和产抗菌物质能力影响很大，如图2结果显示，当pH 6～7时，菌株产量和抑菌圈直径达到最大值。随着pH升高，菌株产量和抑菌活性迅速下降。当pH 8～9时，发酵液基本没有抑菌效果。说明碱性条件对D221菌株有抑制作用，弱酸有利于菌株生存，本试验选择pH 7为最佳D221菌株的最佳发酵环境。

从图3可以看出，菌株生长量随着时间的延长而增加，到40 h菌株产量达到高峰并且趋于稳定。当培养时间为16 h时，发酵液基本没有抗菌活性。抗菌物质在40～56 h产量达到最大值，综合菌株生长量和产抗菌物质的能力的结果，本试验选择48 h为最佳发酵时间，此时抑菌圈直径为25.1 mm；菌株产量为3.89×108cfu·mL-1。

表4 L16（45）正交试验结果Table 4 Factors and levels of L16（45）orthogonal test

图1 不同温度对菌株生长和产抗菌物质的影响Fig.1 Effect of different temperatures on growth and antagonistic substance of strain D221

图2 pH对菌株生长和产抗菌物质的影响Fig.2 Effect of different pH on growth and antagonistic substance of strain D221

图3 培养时间对菌株生长和产抗菌物质的影响Fig.3 Effect of cultivation time on growth and antagonistic substance of strain D221

接菌量为3%～7%时，菌株产量和产抗菌物质能力达到高峰。随接菌量增加，菌株生长量和产抗菌物质能力都下降。当接菌量达到10%时（见图4），二者变化趋与稳定。本试验选用5%接菌量，此时抑菌圈直径达最大24.8 mm，菌株产量为3.91×108cfu·mL-1。

菌株发酵通气量可通过三角瓶内培养基的装液量来控制，从图5可以看出，菌株生长量和抑菌圈直径对通气量的要求基本一致。结果表明，当在250 mL的三角瓶中加入液体培养基量为10～50 mL时，菌株生长量达到最大值。当装液量为30 mL时，拮抗物质的抑菌圈直径最大达25.2 mm。

图4 接菌量对菌株生长和产抗菌物质的影响Fig.4 Effect of different inoculation volume on growth and antagonistic substance of strain D221

图5 通气量对菌株生长和产抗菌物质的影响Fig.5 Effect of different medium volume on growth and antagonistic substance of strain D221

摇床转速是影响摇瓶培养基中通气状况的重要因素。菌体发酵活性产物一般都是好氧过程（见图6）。

由图6可知，结果表明转速为150 r·min时抑菌效果最好，抑菌圈直径为24.9 mm，过低及过高转速对发酵均不利。只有合适的转速(150 r·min)满足发酵所需溶氧量时，发酵液内活性物质性最强。当摇床转速为50 r·min时，发酵液基本没有抗菌活性。

图6 转数对菌株生长和产抗菌物质的影响Fig.6 Effect of different shaker rotation speed on growth and antagonistic substance of strain D221

2.4 培养条件优化后产生抗菌物质的能力

优化后实测抑菌圈直径为31.5 mm，而原始发酵条件下的抑菌圈直径为18.9 mm，因此优化后抑菌圈直径提高了66.7%（见图7）。

图7 优化培养条件后产抗菌物质能力与原始发酵条件的比较Fig.7 Comparison of the ability of produced antagonistic substance in optimized medium with original

3 讨论

a.本试验通过单因子和正交试验对培养基成分进行了优化，但是对发酵条件的优化只进行单因子试验，虽然也得到了一些结论，但是如果想更加全面的了解该菌株的发酵条件，还得需要对这几个不同的发酵条件进行正交试验。

b.本试验在室内摇瓶条件下进行，为工业大规模发酵提供参考。下一步将用自动发酵罐进行验证发酵，以获得更多、更详尽的优化参数，为生产放大做好铺垫。

c.本试验以胰蛋白胨和牛肉膏作为发酵培养基的主要成分，虽然得到的发酵液抑菌活性很高，但成本也高，是否可用其他更便宜的材料替代，应当进一步试验。

d.利用生防菌防治植物土传病害所涉及的影响因素很多，其作用方式各不相同。目前研究比较清楚的主要有重寄生、抗生作用、生态位点竞争以及诱导系统抗性等几个方面。以上几种作用并不相互排斥，往往是协同作用。拮抗细菌D221的抗菌机理，抗菌物质的活性成分是什么，抗菌物质的稳定性等，都有待于进一步研究。

4 结论

a.以2.0%蔗糖作为碳源时菌株产量和抑菌活性都是最高的；D221菌株不能有效利用无机氮源，但是能够很好的利用有机氮源，其中0.5%胰蛋白胨和2.0%牛肉膏效果最显著；供试的无机盐对D221菌株的抑菌活性均有影响，0.5%NaCl和0.1%MgSO4能明显提高D221抑菌活性，但是CuSO4和ZnSO4会抑制菌株生长，抗菌活性有所降低。

b.在250 mL三角瓶内装入30 mL优化后的培养基，把初始pH调至7.0，按5%接种量接入D221种子液，温度30℃，在150 r·min-1的转速下培养48 h得到的无菌发酵液抑菌活性最高。

c.D221菌株生长快，易产生拮抗物质，对辣椒根腐病有较好的防治作用，是一种很有潜力的生防菌，本试验最终确定了D221菌株产拮抗物质的最适培养基和发酵条件，为该菌株的进一步研究与开发应用奠定了基础。

[1] 陆家云.植物病原真菌学[M].北京:中国农业出版社,2001:44.

[2] 李传宝.冬暖式大棚辣椒病害防治措[J].辣椒杂志,2004(1):25-26.

[3] 刘丽云.辣椒根腐病侵染规律初步研究[J].中国植保导刊,2008,28:25-26.

[4] 徐文昌.保护地辣椒主要根部病害的发生与防治[J].蔬菜,2006(3):26-27.

[5] 刘建平.辣椒根腐病药剂防治试验[J].河北农业科学,2005,9(3):117-118.

[6] Whipps J M.Microbial interactions and antagonistic in the rhizosphere[J].Journal of Experimental Botany,2003,56:387-451.

[7] 陈志谊,陆凡,刘春祥,等.水稻纹枯病拮抗细菌B-916培养条件与发酵配方的研究[J].西北农业学报,1998,12(1):76-78.

[8] 杨超英,陶玉贵,徐先炉,等.响应面法优化苏云金杆菌固态发酵培养基[J].中国农学通报,2008,24(7):69-73.

[9] Belofsky G N,Anguera M,Jensen P R,et al.Oxepinamides A-C and fumiquinazolines H-I:Bioactive metabolites from a marine isolate of a fungus of the genusAcremonium[J].Chemistry,2000,6(8):1355.

[10] 韩斯琴，徐梅，白震，等.番茄灰霉病菌拮抗菌D2-4发酵条件的研究[J].东北农业大学学报,2004,35(1):93-98.

[11] 王芳,纪明山,谷祖敏,等.苦参内生拮抗细菌B36菌株最适发酵条件的研究[J].沈阳农业大学学报,2008,39(5):561-564.