虎尾兰的组织培养技术研究

黄凤兰，李 静，张 茜，张 群，赵玲玲，聂民利

（1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古 通辽 028000）

虎尾兰（Sansevieria trifasciatavar.harnii）又称虎皮兰、千岁兰，是龙舌兰科虎尾兰属，多年生常绿肉质草本植物[1]，原产非洲西部，具有较强的耐寒性，且极少发生病虫害，养护较为容易[2]。同时还有净化空气的功效，是优良的室内环保植物，被人们称为“天然的清道夫”[3-5]。虎尾兰的常规繁殖是用扦插或分株方法[6]，但是扦插和分株法繁殖率低，时间较长，而且不易获得大量的植株，且会出现品种退化现象，金边虎尾兰金边性状易消失，影响观赏质量[7]。而采用组织培养育苗方法具有繁殖系数高、保持原品种特性、避免种性分离、种苗不带病毒、生长一致等优点，从而使种苗生产达到规模化、标准化和工厂化的目标。本试验以短叶虎尾兰为研究对象进行组织培养试验，以叶片为外植体，诱导其再生植株，摸索虎尾兰在不同的组织培养阶段所需的培养条件，从而为短叶虎尾兰的组织培养体系的建立奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选用生长健壮的短叶虎尾兰叶片为试材（见图1），2009～2010年期间在内蒙古民族大学生命科学学院组培室内进行。

1.2 培养基及培养条件

基本培养基为MS培养基[8-10]，加入不同的植物生长调节物质，在培养基中添加蔗糖30 g·L-1，琼脂7 g·L-1，pH 5.6～5.8，室内培养温度（25±2）℃，每天光照12 h，光强1 500 lx。

图1 短叶虎尾兰Fig.1 Short leaf orchid

1.3 方法

1.3.1 材料的消毒处理及升汞灭菌时间的筛选

剪取幼嫩的叶片，用流水冲洗30 min以上，再用75%的酒精处理30 s，在0.1%的HgCl2中灭菌，时间设定3、5和8 min共3个梯度，然后用无菌水涮洗8～10次，接种到MS培养基中培养。观察污染情况，计算污染率。污染率（%）=污染的外植体个数（个）/接种的外植体个数（个）×100%。

1.3.2 愈伤组织诱导阶段植物生长调节物质（PGR）最佳浓度配比的筛选

将消毒处理过的外植体分别接种到MS+6-BA（1、2、3 mg·L-1）+NAA（0.3、0.5、0.8 mg·L-1）+2，4-D（0.3、0.5、0.8 mg·L-1）共28个处理组合的培养基中（见表1），25 d后统计各处理组合萌动的外植体数和诱导出的愈伤外植体数，计算萌动率（%）=萌动的外植体个数（个）/接种的外植体个数（个）×100%和愈伤诱导率（%）=长愈伤的外植体数（个）/接种的外植体数（个）×100%，根据结果进行下一步试验，计算平均相对生长速率（%）=30 d增重量（g）/原有重量(g)×100%[11]。

1.3.3 愈伤组织分化阶段PGR最佳浓度配比的筛选

将胚状体分别接种到MS+6-BA（1、2、3、4 mg·L-1）+NAA（0.3、0.5、0.8、1.0 mg·L-1）共 16 个处理组合的培养基中（见表2），接种40 d后开始统计每个处理外植体长芽的个数，计算分化率。分化率（%）=芽的个数（个）/接种的胚状体数（个）×100%，筛选出芽诱导阶段的最佳PGR配比。

表1 愈伤组织诱导阶段的PGR浓度配比Table 1 Ratio of PGR concentration at callus induction phase

表2 芽诱导阶段的PGR浓度配比Table 2 Ratio of PGR concentration at bud induction phase

1.3.4 生根阶段NAA最佳浓度的筛选

目前净水器产业虽然已经比较成熟，但产品依旧存在很多难点需要攻克。例如净水器净化速度慢、净化效果无法确认、废水比太高、噪音大等等问题。尽善尽美无论任何事物都无法做到，但两全其美的净水器却是能够实现的。

将芽分别接种到MS+NAA（0.0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mg·L-1）共6个处理的培养基中，每个处理接种1瓶，3个芽，接种37 d后统计生根情况，筛选出根诱导阶段的最佳NAA浓度。

1.3.5 炼苗、移栽

待培养苗的根长到3～5 cm时即可炼苗、移栽。炼苗时需要去除封口膜，在培养基表面加上薄薄的一层自来水，至于散射光下3～5 d。移栽后，最初10～15 d要通过喷雾或罩上透明的塑料以保持很高的湿度（90%～100%），在塑料罩上打些小孔，以利于气体交换。在保湿数天后，可把植株搬入温室，但仍须遮阴数日，4～6周后即可让小苗在正常的温室或田间条件下生长[12]。

2 结果与分析

2.1 外植体最佳升汞消毒时间的筛选结果

将外植体分别用0.1%的升汞处理3、5和8 min，15 d后统计外植体的污染率，统计结果见表3。由表3可以看出，升汞消毒3 min接种的外植体没有污染，升汞消毒5 min和升汞消毒8 min接种的外植体污染率也很低，但是考虑到升汞对外植体有毒害，所以选择升汞的消毒时间为3 min。

图2 刚接种后的虎尾兰叶片的生长状态Fig.2 Growth state of orchid blade inoculated justly

表3 不同消毒时间对外植体生长状况的影响Table 3 Effect of different sterilization time on explants growth state

2.2 愈伤组织诱导阶段生长调节物质（PGR）最佳浓度配比的筛选

将叶片接种到MS培养基中，1～15号处理在10月12日接种，接种54 d后观察生长状态并统计，统计结果见表4。由表4可知，5、9、13号处理与其他处理相比较萌动率和愈伤诱导率均比较高。

选择生长状态好且状态一致的愈伤组织材料分别接种到5、9、13、16、22、23号处理中，接种时间为1月14日，于接种后30 d观察统计，计算其平均生长速率，统计结果见表6。由表6可以看出，5号处理与其他处理相比较，平均相对生长速率增加最多，达到42.3%，因此5号PGR浓度（1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-12，4-D）最适合诱导愈伤组织（见图3）。

2.3 愈伤组织分化阶段PGR最佳浓度配比的筛选结果

将状态一致的胚性愈伤组织在1月14日分别接种到1～16号处理中，接种后60 d观察胚性愈伤组织的生芽状况并统计，统计结果见表7。由表7可以看出，9号处理的芽分化率最高，达到233%。由此可知，9号处理PGR的配比浓度（1 mg·L-16-BA+0.8 mg·L-1NAA）适宜诱导芽的生成（见图4）。

表4 愈伤诱导阶段接种54 d后不同PGR浓度外植体的生长状况Table 4 Growth state of explants of different PGR concentrations in callus induction stages after 54 d inoculation

表5 愈伤诱导阶段接种40 d后不同PGR浓度外植体的生长状况Table 5 Growth state of explants of different PGR concentrations in callus induction of stages after 40 d inoculation

表6 愈伤组织诱导阶段外植体的增重状况Table 6 Weight status of explants in callus induction stage

图3 长胚性愈伤的外植体Fig.3 Explants of embryogenic callus

图4 长芽的胚状体Fig.4 Embryoids growing buds

表7 愈伤组织分化阶段胚状体的生长状况Table 7 Growth state of embryoid in callus induction stage

2.4 生根阶段NAA的最佳浓度的筛选结果

将幼苗转移到不同NAA浓度的MS生根培养基中，2月27日接种，在接种38 d后观察芽的生根情况并统计，结果见表8。由表8可知，1号处理的生根率最高达到100%，而且根的状态很好，因此1号处理的NAA浓度（0.1 mg·L-1）适宜诱导根的生成（见图5）。

表8 生根阶段根的生长状况Table 8 Growth state of roots in rooting stage

图5 生根的芽Fig.5 Buds grow root

3 讨 论

3.1 叶片的选择时期

试验选材应选择生长一段时间的嫩叶片。在试验过程中，选取的材料有新生长出来的幼嫩叶片，生长一段时间的嫩叶片和老叶片，观察时发现，老化的叶片，虽然未受到升汞的伤害但是愈伤诱导率非常低。刚生长出来的嫩叶片，容易受到升汞的伤害导致死亡而不能萌动产生愈伤组织。

3.2 组织培养苗的退化

虎尾兰的品种有很多，繁殖的方法有扦插和分株法，但是金边和银边虎尾兰要保持其优良品种特性，避免出现返祖现象，只能用分株法，这就使其繁殖速率大大的降低，不能满足市场的需求，而利用组织培养方法快繁虎尾兰植株，既能提高植株繁殖速率，又能保持原品种的特性。

3.3 升汞的消毒时间

升汞虽然是剧毒物质，但是对外植体有很好的消毒效果，一般在组织培养时都会选择升汞对外植体进行消毒。消毒时间的长短随植物的不同而有差异，本试验对虎尾兰叶片的消毒时间进行了摸索，以保证既能达到很好的消毒效果，又不会对外植体造成伤害，本试验得出的结果是0.1%升汞消毒时间为3 min。但是1987年娄渊祥等以虎皮兰叶片为外植体快繁虎皮兰，其0.1%的HgCl2的消毒时间为8 min[9]，为了避免外植体造成伤害，消毒时间越短越好，所以既然消毒3 min的效果也很好，最好选择3 min。

3.4 IBA对生根的影响

IBA也同NAA一样可诱导芽快速的生根，本试验没有对其进行研究，对于IBA的浓度对生根率的影响有待于进一步的研究。

4 结 论

虎尾兰叶片表面用0.1%升汞消毒3 min，污染率低，褐化/死亡率低，成活率高，效果最好。愈伤组织诱导培养基以MS+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-12，4-D最有利于愈伤组织的生成。诱导芽的培养基以MS+1 mg·L-16-BA+0.8 mg·L-1NAA为最佳，不仅生成的芽多，而且健壮。生根培养基以MS+0.1 mg·L-1NAA最有利于根的生成，根的生长速度快，质量好。

[1] 李泽鸿,张璐,刘文涛,等.虎皮兰中4种重金属元素的含量测定[J].北方园艺,2010(1):153-154.

[2] 周宇,闫国华,张开春,等.虎尾兰叶片切段扦插育苗技术[J].中国花卉园艺,2006(4):25-26.

[3] 林丽仙,谢志南,苏明华,等.虎尾兰吸收甲醛及其保护酶活性的初步研究[J].福建农业学报,2009,24(3):258-261.

[4] 李庆军.观赏植物吸收居室甲醛能力的比较[D].哈尔滨:东北林业大学,2006:22.

[5] 吴华芬.健康花卉—虎尾兰室内养护技术和应用[J].现代园艺,2009(9):23-24.

[6] 刘英文,付世猛.虎尾兰养护管理要点[J].河北农业科技,2008(17):33.

[7] 谢怡青,温清英.金边虎尾兰的组织培养和快速繁殖[J].农业科技通讯,2007(6):56.

[8] 李勇,杨建芬,张朝成.狐尾龙舌兰的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯,2003(10):474.

[9] 洪向平,陈玉生,黄麒参.剑麻的组织培养快繁技术[J].广西热带农业,2007(5):29.

[10] 张翠玲,文慧婷.龙血树组织培养和快速繁殖[J].云南农业科技,2006(3):27-28.

[11] 王忠.植物生理学[M].北京:中国农业出版社,2005:336.

[12] 李浚明.植物组织培养教程[M].北京:中国农业大学出版社,2002:267-268．