杜仲对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

骆小娟，刘 蒙，张照庆，宋恩峰

(1武汉市第三医院，武汉430060;2武汉大学人民医院)

肾间质纤维化是所有肾脏病进行性发展的最终结果，是导致终末期肾病的主要病理基础。肾小管间质病变程度是决定10 a肾脏存活率的最重要的影响因素，其影响较肾小球病变的严重程度更为重要［1］。诸多因素参与了肾间质纤维化的病程，如细胞外基质(ECM)细胞产生细胞的增殖和活化、血管活性物质和细胞因子的作用以及ECM转换失衡等。结缔组织生长因子(CTGF)是一种富含半胱氨酸的分泌多肽，是TGF-β下游效应因子，介导促纤维化的作用。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是调控ECM代谢的重要酶系，不仅是炎症反应的效应者，也是积极参与者，可通过对炎症介质的调控参与炎症反应，从而影响疾病的进程［2］。杜仲是一传统的补阳药物，临床上常用于配合活血化瘀药物延缓肾间质纤维化的进程，但其作用机制尚未明确，目前所见报道较少。我们于2010年7月～2011年6月进行本研究，应用单侧输尿管梗阻(UUO)模型，通过检测肾组织CTGF和MMP-2表达观察杜仲对肾间质纤维化的防治作用并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠32只(武汉大学人民医院动物中心提供)，体质量(200±20)g。温度(23±2)℃，相对湿度(55±2)%，定时日光灯照射12 h/d，房间保持通风、恒温、安静，定期更换垫料，清洗笼具。

1.2 药物及试剂 CTGF抗体(兔抗鼠多克隆抗体，BA0752)，MMP-2抗体(兔抗鼠多克隆抗体，BA0569)，SP免疫组织化学试剂盒，均购自武汉博士德(Boster)生物有限公司;显色底物为DAB，北京中山生物技术有限公司;杜仲(免煎中药，批号0702014)，由三九医药股份有限公司提供;厄贝沙坦(批号0601137)由杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司提供。

1.3 模型的建立与分组 单侧输尿管结扎诱导肾间质纤维化大鼠模型:10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，取右侧卧位，背部左肋下备皮，常规消毒，选左侧背部肋下0.5 cm为切口，打开腹腔，游离左肾及左侧输尿管，将左侧输尿管用组织钳托起，取中上段，用止血钳夹住，在两端用丝线结扎后剪断左侧输尿管，然后逐层缝合;假手术组打开腹腔后即缝合。随机分为4组:UUO组、假手术组、厄贝沙坦组和杜仲组。每组各8只，组间大鼠体质量无统计学差异。手术前2 d开始给药，假手术组、UUO组均给予等量生理盐水灌胃，厄贝沙坦组给予厄贝沙坦10 mg/(kg·d)、杜仲组给予杜仲6 g/(kg·d)灌胃。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)检测 10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，从颈总动脉采血，离心分离血清用于测定BUN、Scr。BUN采用脲酶—波氏比色法，Scr采用苦味酸法，由武汉大学人民医院生化室测定。

1.4.2 肾组织病理光镜检查 取左侧肾组织用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，以3 μm的石蜡切片行HE、Masson染色。双盲法观察肾皮质间质变化情况。肾小管间质损害程度按Mezzano方法进行半定量分级:0级正常;Ⅰ级为肾小管上皮细胞轻度萎缩、变性，坏死轻，呈灶性分布，少量散在炎性细胞浸润，纤维组织增生成小灶状、少量分布，病变范围＜25%;Ⅱ级为肾小管上皮细胞中度萎缩、变性，坏死轻，炎性细胞浸润，纤维组织中度增生，病变范围25% ～50%;Ⅲ级为肾小管上皮细胞萎缩、变性和坏死重，呈片分布，大量弥漫或聚集成灶的炎性细胞浸润，纤维组织增生呈束状、多灶或网状成片，病变范围＞50%。观察连续不重叠的10个高倍皮质视野，综合进行评定。光镜下观察肾脏组织皮质区肾小管及间质的结构及变化。切片应用HPIAS-1000高清晰彩色病理图象分析软件分析，每张切片随机选取5个高倍视野，测定一定面积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度值，阳性信号指数(PI)=阳性信号面积×阳性信号平均灰度/测定面积。

1.4.3 肾组织免疫组织化学(SP法) 按SP法试剂盒说明进行CTGF、MMP-2表达检测。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据以¯x±s表示，计数资料采用χ2检验，多组计量资料间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾功能检测 见表1。

表1 各组大鼠Scr、BUN水平检测结果(¯x±s)

2.2 肾组织HE和Masson染色光镜观察结果 光镜下假手术组肾小球及肾小管间质正常;UUO组肾小管上皮细胞弥漫空泡变性，多数肾小管扩张、萎缩，间质多灶状单核细胞浸润和纤维化;杜仲组间质内炎细胞则呈小灶性浸润，少许上皮细胞肿胀，少部分肾小管轻度扩张，肾间质未见明显纤维化。Masson染色见假手术组肾脏的胶原染色主要位于肾小球基膜、Bowman囊、系膜区和肾小管的毛细血管周围，而肾小管周围间质部分则比较狭窄;UUO组可见肾间质大量胶原纤维增生，间质胶原纤维呈蓝色染色，间质纤维化呈灶状分布，肾小球病变不明显，偶见肾小球局灶性节段性硬化;杜仲组上述改变均有所减轻，杜仲组与厄贝沙坦组组间比较无显著性差异(P＞0.05)。假手术组肾小管间质病理分级0、Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级分别为8、0、0、0 例，UUO 组分别为0、4、3、1 例，厄贝沙坦组分别为 1、4、2、1 例，杜仲组分别为1、5、2、0 例。

2.3 免疫组织化学测定

2.3.1 CTGF蛋白表达分布 假手术组大鼠肾小管上皮细胞胞质、肾小球脏层上皮细胞和内皮细胞、间质血管壁有少量表达，染色为颗粒状，着色稀疏;UUO组肾小管上皮细胞胞质中表达明显增多，呈不均匀颗粒状，且与局部炎细胞浸润、间质增宽及肾小管损伤程度一致，肾小球表达不明显;杜仲组表达较UUO组明显降低，但仍较假手术组明显增高。见表2、封三图11。

2.3.2 MMP-2蛋白表达分布 MMP-2主要位于皮质肾小管上皮细胞管腔侧细胞质和细胞膜中，在肾小球和肾间质中仅有少量分布;UUO组MMP-2表达较假手术组明显减弱且分布面积减少;厄贝沙坦组和杜仲组MMP-2的表达较UUO组显著增强且面积增加，但二组间无显著性差异。见表2、封三图12。

表2 各组大鼠CTGF和MMP-2的PI值变化(¯x±s)

3 讨论

肾间质纤维化是各种原因所致的肾脏疾病慢性进展，最终导致肾功能衰竭的共同机制，其主要病理基础是ECM代谢失衡，在间质异常积聚。目前研究认为其发生机理可能如下［3］，一方面，间质炎细胞浸润和各种细胞因子释放，成纤维细胞激活和肾小管上皮细胞表型转化，生成肌成纤维细胞(MF)，MF具有强大的增殖、分泌能力，可产生过多的 ECM成分;另一方面，调控ECM代谢的基质降解酶系统(MMPS/TIMPS系统和PA/PAI系统)在各种细胞因子、细胞等因素作用下发生功能紊乱，使ECM降解减少。

UUO动物模型是研究单纯性肾间质慢性炎症和肾间质纤维化的理想模型。有学者发现，与对照组相比UUO组大鼠梗阻侧肾组织CTGF mRNA随着TGF-β而显著上调，继之出现FN mRNA明显上升、CTGF mRNA显著增加［4］。本实验免疫组化的结果显示:假手术组肾小管上皮细胞、肾间质细胞有较弱CTGF表达，其余各组大鼠的肾间质中均有不同程度的表达，表现为黄褐色颗粒状沉积，尤其在UUO组。术后2周UUO组、厄贝沙坦组与假手术组相比较CTGF表达呈显著性增强，CTGF在厄贝沙坦组的表达显著减弱于UUO组。MMP-2主要位于皮质肾小管上皮细胞管腔侧细胞质和细胞膜中，在肾小球和肾间质中仅有少量分布，UUO组MMP-2表达较假手术组明显减弱且分布面积减少，厄贝沙坦组和杜仲组MMP-2的表达较UUO组显著增强且面积增加，二者无显著性差异。

杜仲的主要功效成分有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖类、杜仲扩真菌蛋白，此外杜仲还含有丰富的营养成分，包括氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素等。杜仲具有调节血压、降低血糖、调节血脂、抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长等药理作用，以及延缓衰老、美白养颜、滋阴补肾、强壮筋骨等功效，是我国名贵的滋补中药材，在中药古典《神农本草经》、《本草纲目》中就被列为药之上品［5］。本实验发现杜仲能减轻肾间质纤维化，作用与厄贝沙坦相似，可抑制CTGF在UUO大鼠肾皮质中表达的上调，增强MMP-2在肾间质的表达。提示杜仲可能通过抑制CTGF在UUO大鼠肾小管上皮表达的上调，从而延缓肾小管损伤及间质纤维化的进展。

总之，杜仲抗肾纤维化的作用值得肯定，它可通过抑制CTGF的表达和增强MMP-2的活性进而抑制纤维化的进展。但是，其确切分子机制尚有待于进一步研究。

［1］Alexopoulos E，Papagianni A，Papadimitriou M.Is membranous nephropathy only a glomerular disease［J］.Rena Fail，1998，20(1):1-6.

［2］Beaudeux JL，Giral P，Bruckert E，et al.Matrix metalloproteinases，inflammation and atherosclerosis:therapeutic perspectives［J］.Clin Chem Lab Med，2004，42(2):121-131.

［3］Zeisberg M，Maeshima Y，Mosteman B，et al.Renal fibrosis:extracellular matrix microenvironment regulates behavior of activated tubular epithelial［J］.Pathol，2002，160(6):2001-2008.

［4］Yokoi H，Mukoyama M，Sugawara A，et al.Role of connective tissue growth factor in febronectin expression and tubulointerstitid fibrosis［J］.Am J Physiol，2002，282(5):F933-F942.

［5］盛军利，孙桂菊.杜仲的功效学研究现状及其应用前景［J］.医学综述，2006，12(16):1022-1024.