N-乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠肾脏保护作用的研究

许 琳

(泰山医学院附属泰山医院肾内科，山东泰安 271000)

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并发症之一，其发生与细胞外基质合成增加及降解减少密切相关。其中，MMP－9和TIMP－1在降解中起重要作用。N－乙酰半胱氨酸(NAC)为一含有巯基的化合物，在临床治疗中发现其有降尿蛋白、延缓肾功能减退等作用。本研究对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型大鼠给予NAC治疗，观察其对糖尿病大鼠肾小球细胞外基质影响，从而探讨NAC对糖尿病肾脏保护的作用机制。

1 材料与方法

1．1 动物模型制备与分组 SPF级雄性SD大鼠30只，随机分为正常对照组(n=10)和模型组(n=20)。模型组腹腔注射链脲佐菌素溶液60 mg·kg－1，72 h后血糖仪测尾静脉血血糖(BS)≥16.8 mmol·L－1，确定造模成功，进而随机分为糖尿病组(n=10)和治疗组(n=10)。治疗组给予NAC 125 mg·kg－1·d－1灌胃。糖尿病组及正常对照组每天生理盐水1．5 ml灌胃。实验期间大鼠自由饮食、饮水。

1．2 生化指标测定 第8周末用代谢笼准确收集24 h尿标本，测定24小时尿微量白蛋白排泄。股静脉采血测血肌酐。

1．3 肾小球硬化指数测定 取出肾脏，称重，福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片约3um厚，行HE及PAS染色。采用Raij［1］等的半定量方法评估肾小球硬化程度，计算肾小球硬化指数(GSI)。

1．4 免疫组织化学测定 采用SP法检测肾组织中纤维连接蛋白(FN)和胶原Ⅳ。抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司，检测按照试剂盒说明书进行

1．5 RT－PCR RT－PCR方法测定肾组织MMP－9，TIMP－1的表达。采用TRIzol(Gibco公司)试剂一步抽提法提取总RNA，再逆转录成cDNA(Promega逆转录试剂盒)。以适量 cDNA为模板，在TAqDNA聚合酶催化下行PCR，参照文献设计PCR引物，MMP－9上游引物:5/－TGCCCCATGTCACTTTCCCTTCA －3/，下 游 引 物:5/－ CATCCGAGCGGCCTTTA GTGGTG －3/，204bp;TIMP －1上游引物:5/－GTCATCGAGACCCCAAGGTA－3/，下游引物:5/－GTGTTTCCCTGTTCAGCCAT－3/，186bp;GAPDH上游引物:5/－ACCACAGTCCATGCCATCAC －3/，下游引物:5/－TCCACCACCCTGTTGCTGTA －3/，452bp，由上海生工技术服务有限公司合成。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳，采用YDN－2000图像分析系统进行分析，以与GAPDH吸光度比值表示其相对量。

1．6 统计学处理 应用 SPSS 13．0软件进行统计分析。数据结果用(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，以 P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 生化指标 与正常对照组比较，糖尿病组和治疗组大鼠血糖水平、肾重/体重、尿微量白蛋白均升高，差异有统计学意义(P＜0．01或P＜0．05);与糖尿病组比较，治疗组大鼠血糖水平差异无统计学意义(P＞0．05)，但大鼠肾重/体重、尿微量白蛋白降低，差异有统计学意义(P＜0．01或 P＜0．05)。结果见表1。

表1 各组生化指标及尿微量白蛋白比较(n=10)

2．2 肾脏病理结果 光镜下可见糖尿病组及治疗组肾小球体积增大，系膜细胞及系膜基质增生，间质单核淋巴细胞浸润，GSI较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P＜0．01)，而与糖尿病组相比，治疗组GSI明显降低，差异有统计学意义(P＜0．01)。正常对照组未见明显异常。见表2。

2．3 免疫组化结果 对照组大鼠肾脏胶原Ⅳ、FN表达较弱，糖尿病组表达增强，差别有统计学意义(P＜0．01)。而在治疗组，其表达虽增强但仍较糖尿病组轻，差别有统计学意义(P＜0．01或 P＜0.05)。见表2。

表2 各组FN、胶原Ⅳ及肾小球硬化指数比较(n=10)

2．4 RT－PCR结果 正常情况下MMP－9、TIMP－1mRNA在肾组织均有表达，在糖尿病组TIMP－1mRNA表达增高，MMP－9mRNA表达减弱。与之相比，治疗组 TI MP－1mRNA表达则明显减少，MMP－9mRNA表达增加，差别有统计学意义(P＜0．01 或 P ＜0．05)。见表3，图1。

表3 各组MMP－9、TIMP－1mRNA表达的比较(n=10)

图1 Lane1～3分别为对照组、糖尿病组、治疗组

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症之一，以肾小球基底膜增厚，系膜细胞、系膜基质增生及肾小管上皮细胞变性、萎缩为基本病理改变，这些病理变化导致肾脏细胞外基质(ECM)异常积聚，最终引起肾小球硬化和肾小管间质纤维化。目前认为ECM的降解减少和合成增加均可促进肾小球进行性硬化［3］，其中基质金属蛋白酶系统在 ECM 降解起主要作用［4］。

胶原Ⅳ是构成肾小球、肾小管主要的胶原成分，可反映肾脏基底膜胶原蛋白的代谢状态［5］，其代谢失衡过程导致肾小球ECM异常积聚，引发肾小球硬化和间质纤维化。MMP－9是ECM降解过程中重要的酶之一，主要降解Ⅳ、Ⅴ型胶原以及明胶、纤连蛋白、弹性蛋白;TIMP－1是 MMP－9特异性抑制剂，可阻断MMP－9对 ECM的降解，二者在调节ECM的积聚和降解平衡方面起关键作用。

NAC作为一种巯基供给体，具有抗细胞凋亡、清除氧自由基、减轻炎症反应，保护组织器官的作用［6］。本研究肾脏病理切片发现，正常对照组肾组织基本正常，而DM组肾组织可见肾小球基底膜增厚，系膜区扩大，系膜基质和系膜细胞增生，肾小球硬化指数明显升高;NAC干预治疗后，病理改变较模型组明显减轻，肾小球硬化指数降低，提示NAC具有减轻DN病理损害的作用，进一步证实NAC具有保护肾脏和延缓DN发生、发展的作用。另外在本试验第8周可见DM组胶原Ⅳ、纤连蛋白及TIMP－1mRNA的表达增高，MMP－9mRNA的表达降低，相反在对照组则有明显MMP－9mRNA表达，胶原Ⅳ、纤连蛋白及TIMP－1mRNA的表达则较低，半定量分析比较有显著性差异，提示上述因素均参与糖尿病肾病发病，这与以往的研究是一致的。NAC干预治疗后，与DM组相比，肾组织胶原Ⅳ、纤连蛋白的表达明显降低，GSI降低，TIMP－1mRNA的表达降低，MMP－9mRNA的表达增高，半定量分析有显著性差异。提示在NAC通过上调MMP－9mRNA的表达，抑制TIMP－1mRNA的表达，调节MMP－9/TIMP－1比值之间的平衡，促进胶原Ⅳ、纤连蛋白的降解，从而增加ECM降解，减少ECM的积聚，减轻肾小球硬化，起到肾脏保护作用。这也为我们临床应用NAC治疗糖尿病肾病提供了理论依据。

［1］ Raij L，Azar S，Keane W．Mesangial immune injury hypertension，and progressive glomerular damage in Dahl rats［J］．Kidney Int，1984，26:137．

［2］ Tanaka R，Sugihara K．Internephron heterogeneity of growth factors and sclerosis－modulation of platelet－derived growth factor by angiotensin［J］．Kidney Int，1995，47:131．

［3］ 高春芳，陆伦根．纤维化疾病的基础和临床［J］．上海:上海科学技术出版社，2004:60-66．

［4］ 刘茂东，李英．基质金属蛋白酶、纤溶酶与糖尿病肾病［J］．河北医药，2002，24(2):148-149．

［5］ Song Y，Li C，Cai L．Fluvastatin prevents nephropathy likely through suppression of connective tissue growth factor-mediat-ed extracellular matrix accumulation［J］．Expert Molec Pathol，2004，76(1):66-75．

［6］ Zafarullah M，Li WQ，Sylvester J，et al．Molecular mechanisms of N-acetylcysteine actions［J］．Cell Mol Life Sci，2003，60(1)6-20．