原发性鼻腔非霍奇金淋巴瘤缺失型潜伏膜蛋白1表达及其与预后的关系

陈 东

(泰山医学院附属泰山医院耳鼻咽喉头颈外科，山东泰安 271000)

原发性鼻腔非霍奇金淋巴瘤(non－Hodgkin’s lymphomas，NHL)是指源于或者限制于鼻腔的头颈部非霍奇金淋巴瘤。大量研究表明，鼻腔淋巴瘤与Epstein－Bar(EB)病毒具有高度相关性，EB病毒在NHL发病机制中的作用至今罕见报道。潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)作为EB病毒表达的潜伏膜蛋白中的一种，已被证实为病毒癌蛋白，近年的研究发现，LMP1基因C末端30bp碱基的缺失与其致瘤性密切相关，可能在肿瘤的发生发展中起着重要作用，但其在淋巴瘤发病机制中的作用目前仍不清楚。为初步探讨缺失型LMP1在原发性鼻腔NHL发病和疾病进展中的作用，我们采用免疫组织化学方法检测55例鼻腔NHL和25例慢性鼻窦炎LMP1蛋白表达，应用PCR从基因水平检测LMP1基因，分析缺失型LMP1在上述病例中的表达情况及其与预后的关系。

1 材料和方法

1．1 临床资料

原发性鼻腔NHL病例55例选自1998年1月至2002年12月期间在泰安市中心医院确诊的患者，女21例，男34例，年龄16岁～64岁，平均年龄为44岁。对照组为在院接受手术治疗的慢性鼻—鼻窦炎患者25例。活检或术后标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。

1．2 方法

1．2．1 免疫组化方法

采用二步法Envision System，在石蜡包埋组织4 μm切片上，检测LMP1蛋白。抗体的浓度及抗原修复按常规方法。以已知的阳性标本作为阳性对照，以PBS缓冲液取代一抗作为阴性对照。免疫组化抗体购于DAKO基因公司。

1．2．2 PCR 方法

1．2．2．1 提取石蜡组织DNA 切取10 μm厚度的石蜡包埋标本20张，放入2 ml Eppendorf管，二甲苯脱蜡，酒精去除二甲苯。按 DNA抽提试剂盒SK1342(上海生工生物工程技术服务有限公司)的操作步骤提取DNA。

1．2．2．2 引物 EB病毒 LMP－1引物引自2004年 Tseng－ tong Kuo［1］等的报道，引物序列:上游 5’－AGCGACTCTGCTGGAAATGAT－3’，下游 5’－TGATTAGCTAAGGCATTCCCA －3’，预期扩增片断为316/286bp。内参照选人β－globin基因片断，引物序列:上游5’－CAACTTCATCCACGTTCACC－3’，下游 5’－ GAAGAGCCAAGGACAGGTAC －3’，预期扩增片断为268bp。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1．2．2．3 PCR 扩增EB 病毒LMP1基因片段:反应体系是 20 μl，其中上游引物(2．5 pmol/μl)和下游引物(2．5 pmol/μl)各 1 μl，10 × PCR Buffer 2 μl，25 mmol/L MgCl2 1．6 μl，dNTPs 200 μmol，Taq DNA聚合酶1 U，模板4 μl，以双蒸水补足至总体积20 μl。阳性对照为 B95．8细胞株 DNA(含野生型LMP1基因)，以双蒸水代替DNA模板作为阴性对照。94℃预变性5 min，94℃ 45 s变性，55℃ 45 s退火，72℃ 1 min延伸，共35个循环，末循环72℃7 min。

1．2．2．4 电泳 采用2．0%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)，取 10 μl PCR 产物和2 μl loading Buffer的混合液进行电泳，紫外灯下照相。

1．2．2．5 质量控制 采用一次性的试验材料，试剂小量分装，DNA提取、扩增操作及结果判断在不同工作间进行。所用样本进行内参照PCR扩增，用以检测蜡块包埋组织是否提取出DNA，排除假阴性结果。

1．3 统计学处理

采用SPSS 17．0统计软件分析数据。原发性鼻腔NHL和慢性鼻－鼻窦炎的缺失型LMP1的差异采用χ2检验分析，生存分析采用Kaplan－Meier分析，log－rank检验比较生存曲线，均以P＜0．05为差异有统计学意义。

1．4 结果判断

LMP1阳性信号分布在细胞质和细胞膜，呈棕黄色染色。PCR扩增出LMP1基因片断为316/286 bp。

2 结果

2．1 免疫组化结果

在55例鼻型NHL中，LMP1阳性率为29/55(53%)，见图1。

2．2 PCR 检测结果

LMP1基因阳性率为33/55(60%)，其中缺失型LMP1基因片断为286bp，野生型LMP1基因片段为316 bp，缺失型LMP1条带较野生型条带略靠前，扩增条带见图2。其中免疫组化LMP1蛋白检出阳性者均扩增出LMP1基因片段。

图1 鼻腔非霍奇金淋巴瘤中肿瘤细胞LMP1阳性(SP×200)

图2 鼻腔NHL LMP－1基因表达(316/286bp)M:Marker;P:野生型LMP1 阳性对照;B:阴性对照;1 ～8:检测标本;1，2，3，8为缺失型LMP1基因条带;6，7为野生型LMP1基因条带;4，5 为阴性。

2．3 缺失型LMP1基因在原发性鼻腔NHL和慢性鼻－鼻窦炎中的差异

原发性鼻腔NHL中LMP1基因阳性率为33/55(60%)，其中缺失型 LMP1基因者为 26/33(78.8%);慢性鼻－鼻窦炎中LMP1基因阳性率为14/25(56%)，其中缺失型潜伏膜蛋白1基因者为5/14(35.7%)，见表1。χ2检验分析显示缺失型LMP1基因在原发性鼻腔NHL和慢性鼻－鼻窦炎患者中的表达差异有统计学意义(P=0．02，χ2=5.386)。

表1 原发性鼻腔NHL和慢性鼻窦炎患者LMP1基因统计表格

2．4 随访资料

全部原发性鼻腔NHL患者随访至2011年9月。观察对象为LMP1基因阳性的鼻腔NHL33例，其中LMP1缺失型26例，LMP1野生型7例，临床分期均为ⅡE期(Ann Arbor分期标准)，确诊后均接受放疗联合化疗。生存期为确诊至死亡或最后随访时间，中位随访时间为61个月，15例死于肿瘤转移或复发，失访6例按截尾值统计，鼻腔NHL患者的5年总生存率为52．4%，其中缺失型LMP1和野生型LMP1的5年生存率分别为36．0%和85．7%，生存分析显示LMP1缺失型鼻腔NHL预后较野生型 LMP1差(P=0．04，log－rank检验)，生存曲线见图3。

图3 LMP1缺失型和野生型NHL Kaplan－Meier生存曲线

3 讨论

EB病毒是一种DNA疱疹病毒，在发展中国家感染率较发达国家更常见，它与原发性鼻腔淋巴瘤具有高度相关性［2］，它的一些基因产物在动物实验和体外细胞培养中的致瘤性已经得到证实。LMP1是EB病毒表达的潜伏膜蛋白中的一种，其具有在体外转化裸鼠的成纤维细胞并使其癌化，被认为是EB病毒的致癌基因［3］。LMP1在鼻腔NK/T细胞淋巴瘤中的表达证明EB病毒基因组可被转录和翻译成蛋白质，表明肿瘤细胞内的EB病毒并不是一个沉默的过程，而是致病的一个重要因素。LMP1基因在EB病毒相关疾病发病及进展中的作用尚待进一步研究。1991年Hu等首先报道EB病毒感染的鼻咽癌CAO细胞株LMP1 C末端存在30 bp缺失，此缺失型LMP1细胞株致瘤性和细胞转化能力比野生型B95．8细胞株明显增强［4］。C端区是LMP1的基本功能区域，删除这个区域LMP1将失去对B细胞表面标志物活化能力和转化能力，特别是C端的30 bp对LMP1转化细胞具有重要作用。碱基的缺失或突变促进了抗原表位的突变，可递呈给细胞逃逸宿主免疫监视的能力［5］。进一步研究发现缺失型LMP1和野生型LMP1存在显著的功能差异，30bp缺失的区域对完善LMP1蛋白功能起重要作用［6－8］。有研究［9］支持 LMP1 缺失型 EB 病毒选择性地感染肿瘤组织的结论，认为其可能在EB病毒相关肿瘤的发病过程中起重要作用。本研究对55例原发性鼻腔NHL和25例慢性鼻－鼻窦炎LMP1基因进行检测，结果显示鼻腔NHL中缺失型LMP的检出率高于慢性鼻－鼻窦炎，差异有统计学意义，P=0．02，支持上述观点。

缺失型LMP1是否在鼻腔NHL进展中发挥重要作用目前尚无定论。赵莎等［10］通过对55结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的研究显示，LMP1野生型和野生为主型的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤预后优于LMP1缺失型和缺失为主型，不能简单地将LMP1缺失型作为结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的致病因素，但也不能完全否定其促进该淋巴瘤演进的作用。Chang等［11］在鼻咽癌研究的中也提示LMP1缺失型与预后差有关。刘俊茹等［9］通过对48例NHL的临床特征分析研究认为，LMP1缺失型与疾病的恶性进展、组织恶性度及预后相关，可作为判断病情及监测预后的一个指标。本研究发现在33例LMP1基因阳性的鼻腔NHL中，缺失型LMP1者有26例，结合随访资料进行统计学分析，LMP1缺失型和LMP1野生型的5年生存率分别为36．0%和85.7%，生存分析显示二者生存曲线差异有统计学意义，P=0.04，表示LMP1缺失型鼻腔NHL预后较LMP1野生型差，提示缺失型LMP1在原发性鼻腔NHL的发病和病情进展中可能起重要作用，其作用机制和与疾病进展的确切关系还需进一步研究。

［1］ Kuo TT，Shih LY，Tsang NM．Nasal NK/T cell lymphoma in Taiwan:a clinicopathologic study of 22 cases with analysis of histologic subtypes Epstein－Barr virus LMP－1 gene association and treatment modalities［J］．Int J Surg Pathol，2004，12(4):375 －387．

［2］ Woo JS，Kim JM，Lee SH，et al．Clinical analysis of extranodal non － Hodgkin’s lymphoma in the sinonasal tract［J］．European Archives of Oto－Rhino－Laryngology，2004，261(4):197－201．

［3］ Wang D，Liebowitz D，Kieff E．An EBV membrane protein expressed in immortalized lymphocytes transforms established rodent cells［J］．Cell，1985，43(3 Pt 2):831 － 840．

［4］ Hu LF，Zabarovsky ER，Chen F，et al．Isolation and sequencing of the Epstein－Barr virus BNLF－1 gene(LMP1)from a Chinese nasopharyngeal carcinoma［J］．J Gen Virol，1991，72(Pt10):2399－2409．

［5］ Chang ET，ADAMI HO．The enigmatic epidemiology of nasopharyngeal carcinoma［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2006，15(10):1765－1777．

［6］ Blake SM，Eliopoulos AG，Dawson CW，et al．The transmembrane domains of the EBV－encoded latent membrane protein 1(LMP1)variant CAO regulate enhanced signaling activity［J］．Virology，2001，282(2):278 －287．

［7］ Fielding CA，Sandvej K，Mehl A，et al．Epstein－ Barr virus LMP－1 natural sequence variants differ in their potential to activate cellular signaling pathways［J］．J Virol，2001，75(19):9129 －9141．

［8］ Vallat－ Decouvelaere AV，Bretel MA，Vassias I，et al．High frequency of a 30－bp deletion of Epstein－Barr virus latent membrane protein 1 gene in primary HIV non－Hodgin’s brain lymphomas neuropathology and applied［J］．Neurobiology，2002，28(6):471－479

［9］ 刘俊茹，林曲，吴祥元．EB病毒潜伏膜蛋白1基因C末端30bp缺失与非霍奇金淋巴瘤的关系［J］．癌症，2005，24(2):145－148．

［10］ 赵莎，刘卫平，王晓凌．结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中EB病毒潜伏膜蛋白1基因30bp碱基缺失的检测意义及其与预后的关系［J］．中华病理学杂志，2005，34(11):720 －723．

［11］ Chang KP，Hao SP，Tsang NM．The 30bp deletion from LMP－1 gene in the clinicopathological manifestation of NPC tumors［J］．Otolaryngol Head Neck Surg，2004，131(1):113 －114．