糖基化终产物对人血管内皮细胞基质金属蛋白酶－2表达和活性的影响

刘 勇 张 寰 顾秀峰 李焕明 刘乃丰 (天津市第四中心医院，天津 30040)

糖尿病患者易患动脉粥样硬化，持久的高血糖状态最终形成具有高度活性的糖基化终产物(AGEs)，而AGEs在动脉粥样硬化的发生、发展中起重要作用。同时，在动脉粥样硬化形成过程中，基质金属蛋白酶(MMPs)扮演了重要的角色，其中MMP－2(明胶酶A)与动脉粥样硬化的关系越来越引起人们关注。在动脉粥样硬化及经皮冠状动脉血管成形术后再狭窄病灶中，MMP－2表达明显增多，血管壁中的内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞都可表达并分泌 MMP－2〔1，2〕。AGEs可能通过作用于血管内皮细胞调控MMP－2的表达和活性，从而影响糖尿病患者动脉粥样硬化的进展。本研究从AGEs对MMP－2表达影响这一角度，探讨其对动脉粥样硬化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人血管内皮细胞株ECV304(上海细胞生物研究所)，牛血清白蛋白(BSA，Amresco公司)，D－葡萄糖(重庆北培化学试剂厂)，M199培养基(低糖，GIBCO公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，Hepes(Amresco公司)，明胶(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 AGE－BSA的制备 在pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中加入BSA及D－葡萄糖(BSA终浓度为5.0 g/L，葡萄糖终浓度为50 mmol/L)，过滤除菌后37℃无菌孵育12 w。对照组BSA不含葡萄糖。

1.2.2 人血管内皮细胞的培养 于37℃，5%CO2培养箱内，以20%小牛血清的M199培养基中培养ECV304细胞，后以0.125%胰蛋白酶消化细胞，调节细胞密度至2×106个/ml，接种于6孔板，2 ml/孔中，继续培养72 h后更换无血清培养基培养24 h，然后分两组，每组均设对照组(Control)及BSA组，两组均不含葡萄糖。第1组加入葡萄糖浓度为50 mmol/L孵育的不同浓度的 AGE－BSA(50、100、200、400 mg/L)分别干预24 h。第2组加入葡萄糖浓度为50 mmol/L孵育的AGE－BSA(浓度为200 mg/L) 分别干预 0、12、24、36、48 h 和 72 h。

1.2.3 内皮细胞总RNA的提取 取干预好的细胞，留取上清，直接于6孔培养板中提取内皮细胞总RNA。用4℃PBS洗涤细胞3次，每孔加入1 ml Trizol，然后分别以氯仿、异丙醇和无RNA酶75%乙醇提取内皮细胞总RNA。用核酸蛋白测定仪测光密度OD260/OD280均在1.7以上，说明RNA纯度较高。

1.2.4 逆转录聚合酶链反应 MMP－2引物依据 McKenna等〔3〕报道的序列，β－肌动蛋白(β－actin)(内参照)引物依据Izumi等〔4〕报道的序列并与基因库(GenBank)上下载的mRNA序列核对无误，均由上海生工生物工程公司合成。MMP－2引物序列:上游5′－CAGGCTCTTCTCCTTTCACAAC－3′，下游5′－AAGCCACGGCTTGGTTTTCCTC－3′，扩增产物长度为 398 bp。β－actin引物序列:上游 5′－GGTCAGAAGGATTCCTATGTG－3′，下游 5′－ATTGCCAATGGTGATGACCTG－3′，扩增产物长度为 615 bp。以2 μg总 RNA为模板，加入 Oligo(DT)18、焦碳酸二乙酯(DEPC)水、逆转录酶(M－MLV)5 × 缓冲液、dNTP、RNasin，总反应体系25 μl，进行逆转录。PCR反应体系及反应条件:cDNA、10 × 缓冲液、MgCl2、dNTP、MMP－2 引物、β－actin 引物、Taq DNA聚合酶，总反应体系50 μl。PCR反应条件:94℃ 2 min，然后94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min 进行30 次循环扩增，72℃延伸8 min。取6 μl PCR产物与1 μl上样缓冲液混合后上样于1.7%琼脂糖凝胶，同时以5 μl 100 bp DNA分子质量标记点样，以0.5×Tris盐溶液(TBE)为缓冲液电泳，用Image Master VDS扫描分析仪扫描凝胶，以β－actin为内参照，用Total Lab分析软件对RT－PCR结果进行吸光度分析，并对PCR产物进行测序(上海申友生物技术有限责任公司)，与GenBank查到的序列对照，核对无误，进一步证实了PCR产物的正确。

1.2.5 明胶酶图检测 MMP－2活性 配制10%分层胶(含0.2%明胶，56℃助溶)、5%浓缩胶。取不同条件刺激的细胞培养液20 μl上样，以恒压 200 V，电泳 45～50 min。凝胶经2.5%Triton X－100漂洗2次，每次10 min，于反应缓冲液〔Tris－HCl 50 mmol/L(pH7.4～7.6);NaCl 50 mmol/L;CaCl210 mmol/L;1%Triton X－100〕中37℃孵育过夜，0.5%考马斯亮蓝R－250(0.5%考马斯亮蓝R－250;45%甲醇;10%乙酸)染色3 h，脱色液(40%甲醇;10%乙酸)脱色至蓝色背景下白色条带清晰可见。明胶酶图结果用Gel－pro32 Analyzer软件进行光密度分析。

1.3 统计学方法 应用Prism3.0统计软件进行分析，数据资料以±s表示，采用 One－Way ANOVA，组间比较采用 Newman－Keuls方法。

2 结果

2.1 RT－PCR法分析AGEs调控MMP－2表达的浓度效应 干预24 h后 Control组 ECV304细胞表达一定量的 MMP－2(0.225±0.024);与 Control组相比，BSA 组对MMP－2的 mRNA表达(0.241±0.041)无影响(P＞0.05);与BSA组比较，AGEBSA各浓度组 MMP－2的表达水平均明显升高(50、100、200、400 mg/L组 MMP－2 mRNA 表达量分别为 0.570±0.020，0.689±0.027，0.882±0.058，0.863±0.031)，差异显著(P ＜0.01)，其中AGE－BSA的浓度为200 mg/L调控 MMP－2的表达效应最佳，见图1。

2.2 RT－PCR法分析AGEs调控MMP－2表达的时间效应 与Control组相比，BSA组对MMP－2的mRNA表达无影响，无明显差异(P＞0.05);与BSA组相比较，AGE－BSA各时间组 MMP－2的表达均明显升高(0、12、24、36、48、72 h MMP－2 mRNA 表达水平分别为0.180±0.025，0.304±0.036，0.677±0.029，0.622±0.018，0.582±0.027，0.561±0.016)，差异有统计学意义(P ＜0.01)，其中在12 h时已经升高，24 h时达到最高(P＜0.01)，以后仍维持较高水平。见图2。

2.3 明胶法分析AGEs调控ECV304细胞MMP－2表达后对其活性的影响 对照组及不同浓度给药组(干预24 h)的培养上清均可在72 kD的位置使明胶发生降解。与 Control组(3.131±0.367)相比，BSA组(3.632±0.730)诱导 ECV304细胞MMP－2表达后对其活性无明显影响，降解明胶无明显差异(P＞0.05);与BSA组相比较，AGE－BSA不同浓度给药组诱导ECV304细胞 MMP－2表达后均能升高其活性(50、100、200 mg/L组 MMP－2 mRNA表达量分别为 6.853±1.017，9.012±1.518，11.968±1.341)，降解明胶逐渐增强(P ＜0.01)。见图3。

图1 不同浓度的AGE-BSA干预ECV304细胞24 h时MMP-2 mRNA的表达

图2 相同浓度的AGE-BSA干预ECV304细胞不同时间点MMP-2 mRNA表达

图3 AGEs调控ECV304细胞MMP-2表达后对其活性的影响

3 讨论

糖尿病血管并发症是最常见的也是最严重的并发症之一。持久的高血糖状态会导致体内蛋白质、脂质等糖基化，经过一系列非酶促反应，最终形成具有高度活性的AGEs。目前的研究表明动脉粥样硬化病灶中可检测出AGE，在糖尿病及冠心病人血清中AGE浓度亦明显升高〔5〕，而且AGE能够增强大鼠主动脉血管平滑肌细胞、单核细胞趋化蛋白1基因和MMP－2的表达，抑制人血管内皮细胞过氧化体增殖物激活型受体γ基因的表达〔6〕。本研究前期的动物实验已经表明糖尿病小鼠血清AGE水平显著增高，而且随糖尿病病程的迁延，其增高的水平越来越明显〔7〕。提示AGE可能通过诱导MMP－2的表达参与糖尿病后血管病变。

本研究表明细胞外基质与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，降解细胞外基质的酶主要是MMPs，而MMPs是酶活性依赖锌离子的蛋白酶超家族，可分为四大类，即胶原酶、明胶酶、基质水解酶和膜型－MMPs(MT－MMPs)。其中MMP－2在血管壁中的平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞上均有表达。在糖尿病患者、急性冠状动脉综合征患者以及患有糖尿病的急性冠状动脉综合征患者中 MMP－2 水平升高〔8〕。Hoffmann 等〔9〕的研究表明，AGE刺激培养的脉络膜内皮细胞MMP－2的表达增加。本实验结果表明，AGE－BSA能够诱导人血管内皮细胞MMP－2表达，并增强其降解明胶活性，且这种效应具有时间和浓度依赖性。糖基化与氧化应激密切相连，蛋白质发生非酶糖化时也有氧自由基的产生，糖化脂蛋白容易发生过氧化，AGEs即氧化糖基化的不可逆产物。氧化应激在糖尿病并发症发生发展中起重要作用，而MMP－2对氧化应激很敏感。最近Kowluru等〔10〕在研究糖尿病视网膜病变的发展中发现，高糖可以促进糖尿病大鼠视网膜内皮细胞MMP－2表达增加、活性增强，而抗氧化应激可以抑制MMP－2的表达。因此，推测AGEs可能通过降低超氧化物歧化酶的活性，使细胞内氧化应激增加，MMP－2表达增加，活性增强，参与了糖尿病后血管动脉粥样硬化的进程。深入研究AGEs与MMP－2之间的相互作用，将为深入了解糖尿病易患动脉粥样硬化的机制及其合理防治提供新思路。

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3 McKenna GJ，Chen Y，Smith RM，et al.Arole for matrix metalloproteinases and tumor host interaction in hepatocellular carcinomas〔J〕.Am J Surg，2002;183(5):588－94.

4 Izumi S，Hirai K，Miyamasu M，et al.Expression and regulation of monocyte chemoattractant protein－1 by human eosinophils〔J〕.Eur J Immunol，1997;27(4):816－24.

5 刘乃丰，孙子林，童嘉毅，等.冠心病患者血清糖基化终产物水平升高的意义〔J〕. 中华心血管病杂志，2001;29(2):94－6.

6 顾秀峰，刘 勇，刘乃丰.糖基化终产物对大鼠主动脉平滑肌细胞MMP－2 表达的影响〔J〕. 天津医药，2006;34(12):871－4.

7 孙子林，刘乃丰，孙桂菊，等.糖尿病小鼠血清糖基化终产物水平增高〔J〕. 中国糖尿病杂志，2000;8(5):315，320.

8 Derosa G，D′Angelo A，Scalise F，et al.Comparison between metalloproteinases－2 and －9 in healthy subjects，diabetics，and subjects with acute coronary syndrome〔J〕.Heart Vessels，2007;22(6):361－70.

9 Hoffmann S，Friedrichs U，Eichler W，et al.Advanced glycation end products induce choroidal endothelial cell proliferation，matrix metalloproteinase－2 and VEGF upregulation in vitro〔J〕.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2002;240(12):996－1002.

10 Kowluru RA，Kanwar M.Oxidative stress and the development of diabetic retinopathy:contributory role of matrix metalloproteinase－2〔J〕.Free Radic Biol Med，2009;46(12):1677－85.