缺血后适应减轻大鼠肢体缺血再灌注后的心肌损伤*

赵利军，门秀丽，李宏杰，孔小燕，吴 静，刘丽华

(河北联合大学基础医学院病理生理学教研室，河北 唐山 063000)

肢体缺血再灌注(limb ischemia－reperfusion，LIR)损伤是一个全身性的病理过程，常可累及心、脑、肺等远隔器官[1]。调动机体内源性保护机制，减轻损伤程度，即预适应，是目前再灌注损伤研究领域的讨论热点。在众多预适应措施中，缺血后适应(ischemic postconditioning，IPostC)因其可操作性方面的优势，逐渐受到人们的重视。IPostC可通过抗氧化酶的激活、抑制炎症反应等启动细胞保护通路[2]。此外，目前关于IPostC器官保护作用的研究多是针对缺血器官本身而言的，临床可行性会受到一定的限制。本研究借鉴缺血后适应的处理方法，观察发生在肢体的IPostC对远隔组织——心肌的保护效应。

材料和方法

1 动物与分组

健康SPF级雄性Wistar大鼠24只，体重200～250 g，购自河南医科大学实验动物中心。动物术前24 h禁食，饮水自由。动物随机分为3组(每组8只):正常对照组(C组)、缺血再灌注组(IR组)和缺血再灌注+缺血后适应组(IR+IPostC组)。

2 动物模型制备及标本采集

复制大鼠LIR模型[1]，使用标准化弹性的橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部阻断血流4 h，然后松解橡皮带恢复血流灌注4 h。C组动物松弛结扎双后肢不阻断血流，IR+IPostC组在4 h缺血后，松解肢体恢复血流灌注5 min，再缺血5 min，反复5次进行缺血后适应，然后再进入4 h血流再灌注阶段。实验结束时自腹主动脉取血，4℃、3500 r/min离心15 min留取血浆，生化测定待用。取心肌组织100 mg，加入1 mL冷生理盐水，冰浴条件下电动匀浆3 min制备10%心肌组织匀浆，3500 r/min低温离心15 min留取上清液，进行心肌组织各项生化指标检测。每组随机取2只大鼠，在取血结束后，迅速在心脏左室游离壁处取材，将取下的组织块立即投入冷的4%戊二醛－磷酸缓冲液，切成1 mm×1 mm×1 mm的小块预固定，后转入2.5%戊二醛中固定，经丙酮脱水、环氧树脂618包埋、超薄切片、染色后在透射电镜下观察心肌组织的超微结构。

3 试剂、设备来源及指标测定

心肌组织匀浆及血清制备应用FSH－II型高速电动匀浆器(江苏金坛金城国胜实验仪器厂)和SIGMA－2M/ETM低温高速离心机(Sigma)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)测定采用生化试剂盒(购自南京建成生物制品公司)，操作步骤严格依照试剂盒说明书进行。速率法测定血清心肌肌钙蛋白I(myocardial troponin I，cTnI)含量，应用肌钙蛋白胶乳增强免疫比浊定量测定试剂盒(太原市川至生物工程有限公司)进行。血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)及其MB同工酶(creatine kinase MB，CK－MB)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和α－羟丁酸脱氢酶(α－hydroxybutyrate dehydrogenase，α－HBDH)测定应用7150型全自动生化分析仪(Hitachi)进行。组织超微结构观察应用JEM－100CX透射电子显微镜(JEOL Ltd.)。

4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包进行分析实验数据，计量资料以均数±标准差()表示，均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 心肌损伤的生化指标检测结果

与C组比较，再灌注后血清CK、CK－MB和cTnI均升高(P＜0.05)。IR+IPostC组与IR组比较，血清CK、CK－MB和cTnI都有所降低(P＜0.05)，见表1。再灌注后，血清AST、LDH和α－HBDH水平均较C组升高(P＜0.05)。IR+IPostC组与IR组比较，血清AST、LDH和α－HBDH都有所降低(P ＜0.05)，见表1。

表1 各组动物血清CK、CK－MB、cTnI、AST、LDH和α－HBDH的变化Table1.The serum levels of CK，CK－MB，cTnI，AST，LDH and α－HBDH in different groups(.n=8)

表1 各组动物血清CK、CK－MB、cTnI、AST、LDH和α－HBDH的变化Table1.The serum levels of CK，CK－MB，cTnI，AST，LDH and α－HBDH in different groups(.n=8)

#P ＜0.05 vs C group;▲P ＜0.05 vs IR group.

Group CK(103U/L) CK－MB(103U/L) cTnI(μg/L) AST(103U/L) LDH(103U/L) α－HBDH(103U/L)C 0.42 ±0.06 0.55 ±0.12 0.38 ±0.06 0.480 ±0.0600.490 ±0.120 0.600 ±0.110 IR 15.37 ±1.67# 19.12 ±2.48# 3.32 ±0.79# 1.837 ±0.670# 3.856 ±0.480# 4.220 ±0.730#IR+IPostC 8.78 ±1.56#▲ 10.58 ±0.73#▲ 1.14 ±0.09#▲ 0.953 ±0.260#▲ 1.058 ±0.410#▲ 2.138 ±0.500#▲

2 氧化应激各项指标的检测结果

2.1 血浆SOD、XOD活性和MDA水平 与C组比较，再灌注后血浆XOD活性和MDA水平升高，而SOD活性下降(P＜0.05)，但IR+IPostC组与IR组比较，血浆XOD活性和MDA水平有所降低而SOD活性有所回升(P＜0.05)，见表2。

2.2 心肌组织SOD、MDA和MPO水平 与C组比较，再灌注后心肌组织MPO活性和MDA水平升高，而SOD活性下降(P＜0.05)，但IR+IPostC组与IR组比较，心肌组织MPO活性和MDA水平有所降低而SOD活性有所回升(P＜0.05)，见表3。

3 心肌组织超微结构变化

电镜下可见C组心肌肌原纤维排列整齐，明暗带清晰，线粒体基质致密，嵴排列紧密整齐，糖原颗粒丰富，见图1A。IR组可见肌丝排列紊乱或消失，基质明显水肿，线粒体大部分或全部的嵴和膜融合或消失，空泡化明显，糖原数量明显减少，见图1B。IR+IPostC组心肌上述病理改变有所减轻，见图1C。

表2 血浆SOD、XOD和MDA水平Table2.The plasma levels of SOD，XOD and MDA in different groups(.n=8)

表2 血浆SOD、XOD和MDA水平Table2.The plasma levels of SOD，XOD and MDA in different groups(.n=8)

#P ＜0.05 vs C group;▲P ＜0.05 vs IR group.

Group SOD(103U/L) XOD(U/L) MDA(μmol/L)C 75.678 ±19.614 34.030 ±1.652 6.500 ±1.095 IR 7.832 ±1.679# 52.980 ±9.358# 38.595 ±15.551#IR+IPostC 54.341 ±9.091#▲ 35.142 ±1.823#▲ 7.119 ±1.067#▲

表3 心肌组织SOD、MPO和MDA水平Table3.The levels of SOD，MPO and MDA in myocardial tissues of different groups(.n=8)

表3 心肌组织SOD、MPO和MDA水平Table3.The levels of SOD，MPO and MDA in myocardial tissues of different groups(.n=8)

#P ＜0.05 vs C group;▲P ＜0.05 vs IR group.

Group SOD[103U/g protein]MDA[μmol/(g protein)]MPO(U/g)C 48.353±13.067 0.226±0.090 0.424±0.076 IR 19.090±10.355# 0.514±0.098# 0.717±0.069#IR+IPostC 27.031±11.921#▲ 0.452±0.071#▲ 0.591±0.037#▲

Figure1.Myocardial tissue ultrastructure in the three groups(×5000).A:C group;B:IR group;C:IR+IPostC group.图1 心肌组织超微结构

讨 论

近年来，减轻再灌注损伤的各种适应机制和措施受到人们的普遍重视。由于组织缺血的发生往往无法提前预知，所以曾备受关注的缺血预适应的临床应用受到很大限制。与预适应相对应，IPostC是在长时间组织器官缺血后，先进行短暂的重复性血管开通及再闭，然后再实施持续性复灌[3]。IPostC中多种细胞外信号可通过G蛋白偶联受体启动细胞内再灌注损伤补救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)通路，从而激活多种细胞内保护性蛋白，有广泛的全身组织保护作用[4]。

缺血再灌注损伤是多因素参与、非抗原依赖性的全身炎症反应过程。我们以前的研究证实，LIR有远隔器官损伤作用，可引发心功能的障碍和心肌组织的损伤等[1]。CK是主要分布在骨骼肌和心肌细胞的胞浆酶，而CK－MB在心肌细胞中含量最多，本实验中对CK和CK－MB的同步观察可排除骨骼肌损伤对心肌酶学指标的干扰。cTnI比CK－MB更具有心肌特异性和灵敏性，是目前最理想的心肌细胞损伤标志物[5]。本实验发现，LIR后心肌细胞胞浆酶CK和CK－MB释放增加，且血中cTnI水平上升，同时观察到心肌细胞肌丝排列紊乱或消失，基质明显水肿，线粒体大部分或全部的嵴和膜融合或消失，空泡化明显，糖原数量明显减少。IPostC组心肌细胞胞浆酶漏出减少，说明IPostC可通过一定机制稳定心肌细胞膜的结构。组织MPO的活性可表示组织中PMN的数量和炎症损伤的程度。LIR后心肌组织MPO活性升高说明心肌组织中PMN增多，而IPostC可抑制PMN的活化和聚集，组织MPO活性降低。LIR后血液和心肌组织中SOD和MDA的变化提示我们，IPostC有抑制体内氧化应激反应和减轻心肌氧化损伤的作用。

在肢体反复多次的缺血－再灌注过程中，血液中内皮源性缓激肽、前列腺素I2(prostaglandin I2，PGI2)、一氧化氮(nitric oxide，NO)等可作为IPostC远隔细胞保护作用的触发器，激活细胞内蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)等，促进终效应蛋白热休克蛋白(heat－shock protein，HSP)或ATP敏感性K+(KATP)通道磷酸化[6]。HSP控制肌动蛋白丝聚合，保证细胞骨架的完整。质膜KATP通道的开放，通过使动作电位3期复级加速而缩短动作电位时程和发生超极化，发挥心肌保护作用。此外，Sun等[7]在研究HSP72过度表达对心肌的保护作用时，检测到了锰超氧化物歧化酶(Mn－SOD)的表达增加。本实验中，血液和心肌组织中的SOD因再灌注引发的过氧化状态而过度消耗，而在IR+IPostC组，观察到了其活性的增加，与Sun等[7]的报道一致。SOD的表达增强，对自由基的清除作用加强，可能是IPostC发挥细胞保护作用的机制之一。关于肢体IPostC对远位器官保护作用的具体分子生物学机制，有待于进一步深入研究。

[1]赵利军，门秀丽，董淑云，等.L－精氨酸对大鼠肢体缺血再灌注后心肌损伤的影响[J].中国药理学通报，2008，24(6):827 －830.

[2]Zhang Y，Leng YF，Xue X，et al.Effects of penehyclidine hydrochloride in small intestinal damage caused by limb ischemia － reperfusion[J].World J Gastroenterol，2011，17(2):254－259.

[3]王 茜，邓凤君，林焕冰，等.cAMP信号分子在缺血后适应心肌保护机制中的作用[J].中国病理生理杂志，2011，27(8):1496 －1501.

[4]Skyschally A，Schulz R，Heusch G.Pathophysiology of myocardial infarction:protection by ischemia pre－and postconditioning[J].Herz，2008，33(2):88 －100.

[5]Men X，Han S，Gao J，et al.Taurine protects against lung damage following limb ischemia reperfusion in the rat by attenuating endoplasmic reticulum stress－induced apoptosis[J].Acta Orthop，2010，81(2):263 －267.

[6]Zhang QL，Sun YB，Bai B，et al.Effects of Salvia miltiorrhiza Bge.f.alba on neuronal regeneration following cerebral ischemia/reperfusion[J].Neural Regen Res，2010，5(14):1066－1070.

[7]Sun H，Guo T，Liu L，et al.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after acute myocardial infarction in pigs[J].Heart Surg Forum，2010，13(5):E305 － E310.